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碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究生物技术1101班其曼古丽·麦麦提201131301028摘要：经过匀浆，正丁醇处理，凝胶过滤等步骤，从猪肝中部分纯化了碱性磷酸酶。以磷酸苯二钠为底物，测得该酶的最适pH为10，最适温度为37℃，Km=1.6565。KH2PO4对酶的活性有不同程度的抑制作用。关键词：猪肝，碱性磷酸酶，分离纯化，性质碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,简称AKP)是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶，广泛存在于人体、动物、植物与微生物中，在生物体内直接参与了磷酸基团的转移和代谢过程【1】。它在脊椎动物的骨化过程中发挥了重要作用【1】。海洋中的甲壳动物锯缘青蟹体内的碱性磷酸酶是其赖以生长、生存的重要酶类之一，它对海水中钙质的吸收、磷酸钙的形成、甲壳素的形成与分泌都具有重要作用【2】。提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究、毒物学研究及医学研究【3】。由于有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，该酶还可添加到药用化妆品中【4】。为了满足生产实践上的需要，仅国内以猪肝为材料来分离纯化碱性磷酸酶并对其性质进行分析的研究工作即已有若干。1.1材料与方法1.1.1实验材料新鲜的猪肝脏。1.1.2试验仪器玻璃匀浆器，离心机，加样抢，恒温水浴锅。1.1.3试验试剂0.5mol/L醋酸镁溶液；2，0.1mol/L醋酸钠；3，0.01mol醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液；4，Tris-HClPH8.8缓冲液；5，正丁醇；6，丙醇；7，95%乙醇；8，0.04mol/L作用物底物；9，0.1mol/L碳酸盐缓冲液（PH10.0）；10，碱性磷酸酶液；11，0.5mol/LNaOH溶液；12，0.3%-氨基安替比林；13，0.5mol/L铁氰化钾；14，基质液，15，0.2m甘氨酸；16，0.2NaOH；1.1.4试剂配制0.5mol/L醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml。0.1mol醋酸钠溶液：8.2g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml。0.01mol/L醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液：准确吸取20ml0.5mol/L醋酸镁溶液及100ml0.14mol/L醋酸钠溶液，混合后定容至1000。Tris-HClPH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为0.1mol/LTris溶液。取100ml0.1mol/LTris溶液，加蒸馏水约780ml，再加0.1mol/L醋酸镁溶液，混合后用1%冰醋酸调PH为8.8，用蒸馏水定容至1000ml。0.04mol/L作用物液：称取10.16磷酸二甲苯二钠，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，存于棕色瓶内，放于冰箱内保存。0.1mol/L碳酸盐缓冲液:取无水碳酸钠6.36及碳酸氢钠3.36，溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml。碱性磷酸酶液：取纯化的碱性磷酸酶5mg，用PH缓冲液配制成100ml，放置冰箱内保存。0.3%4-氨基安替比林：称取3g4氨基安替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解至1000ml。0.5%铁氰化钾：称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中溶解后两液混合加水至2000ml。基质液：称取磷酸苯二钠.2H2O6g，4-氨基安替比林3g，分别溶于煮沸冷却的蒸馏水中，两液混合并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐。1.2试验方法1.2.1碱性磷酸酶的分离纯化取新鲜猪肝20g剪成组织糜，加入0.1mol/L醋酸镁—0.1mol/L醋酸钠60ml，在电动匀浆器上匀浆。取32.5ml肝匀浆液与10ml的正丁醇混合，用玻璃棒充分搅拌3—5分钟后室温放置30分钟，然后用四层纱布过滤。在23.5ml的滤液中加入等量的冷丙酮（-10℃保存）混匀后3000转冰冻离心5分钟，离心后弃去上清液取沉淀，然后加入0.5mol/L醋酸镁20ml混匀，用量筒量取29.5ml悬液，加入96%乙醇12.9ml至30%，3000转离心5分钟。离心后弃沉淀取上清液33.5ml，加96%乙醇27.9ml至65%，3000转离心5分钟。将上清液弃去，在沉淀中加入0.1mol/L醋酸镁—0.1mol/L醋酸钠20ml溶解，再加入96%乙醇9.75ml至30%，3000转离心5分钟，此次离心后弃沉淀取上清液29.5ml，加入96%乙醇24.5ml至60%，3000转离心5分钟，离心后取沉淀，加入0.5mol/L醋酸镁15ml溶解，使溶液总体积为17.5ml，加入99.5%丙酮8.2ml至33%，3000转离心5分钟，取上清液加入99.5%丙酮7.65ml至50%，3000转离心10分钟，得到沉淀后加入pH8.8Tris缓冲液10ml溶解，溶液即为部分纯化的碱性磷酸酶，将其分装成1ml/瓶，置-20℃冰箱保存。1.2.2碱性磷酸酶的动力学鉴定-----Km测定取大试管7支，按下表操作：加入酶液，混匀之后立即记时，各管在37℃水浴中准确保温15分钟后，加入0,5molNaoh液1.0ml以终止反应。显色：各管加入0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%铁氰化钾2.0ml，充分混匀，放置10分钟，以0管为对照在波长510nm下比色，记录各管的吸光度。作图：所测各管的吸光度代表各管中的反应速度v，以之为纵轴，以作物浓度s为横轴，在坐标纸上链接个点作图，观察曲线的形状。以各吸光度值得倒数为纵轴，以作物浓度的倒数为横坐标，作图求出km值。1.2.3碱性磷酸酶的最适PH及酸性稳定性试验PH-活性曲线的制作取6支试管，按下表操作管号123450反应PH8910111210相应PH缓冲液各加0.5ml酶液各加0.1ml（0号管酶液在铁氰化钾之后加）37℃预热5分钟预热的基质液各加3.0ml37℃精确保温15min各加1.0ml碱性溶液终止反应0.5%的铁氰化钾各加2.0ml静置10minA510测试各管的A510值，以反应Ph值为横坐标，A510为纵坐标绘制PH活性曲线，求出碱性磷酸酶在本实验下的最适PH。酸碱稳定范围的测定取6支试管，按1至5管编号，空白管为0号，按下表操作管号123450处理PH8910111210相应PH缓冲液各加0.1ml酶液各加0.1ml37℃处理1小时0.1MPH10的碳酸盐缓冲液各加0.5ml预热的基质液各加3.0ml（0号管基质液在铁氰化钾之后加）37℃精确保温15min各加1.0ml碱性溶液终止反应0.5%的铁氰化钾各加2.0ml静置10minA510测得各管A510值，以PH为横坐标，A510为纵坐标，绘制酸碱稳定曲线，并分析碱性磷酸酶的酸碱稳定范围。1.2.4碱性磷酸酶的最适温度及热稳定性试验。温度-活性曲线的制作取4支试管，按下表操作管号1230反应温度（℃）25378037稀释酶液各加0.1ml（0号管酶液在铁氰化钾之后加）预热的复合基质液各加3.0ml分别在不同温度下精确反应15min，各加1.0ml碱性溶液终止反应各加0.5%的铁氰化钾2.0ml静置10minA510测各管的A510,以反应温度为横坐标，A510为纵坐标，绘制温度-活性曲线图，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适温度。热稳定性取4支试管，按下表操作管号1230热处理温度（℃）25378025热处理时间（分）15151515酶液（ml）各加0.1ml（0号管酶液在铁氰化钾之后加）在上述相应温度的恒温水浴内放置相应时间后取出，立即以流动水冷却并置于37℃恒温水浴锅中预热2分钟预热的复合基质液各加3.0ml37℃精确反应15min，各加1.0ml碱性溶液终止反应各加0.5%的铁氰化钾2.0ml静置10minA510测出各管A510值，以处理温度为横坐标，A510为纵坐标。绘制热稳定曲线，并分析在本实验条件下的碱性磷酸酶的热稳定性值范围。1.2.5抑制剂类型鉴别KH2PO4的抑制剂作用取6支试管，按下表操作管号12345040mmol/L底物溶液0.100.200.300.400.800碳酸盐缓冲液0.90.90.90.90.90.9蒸馏水0.800.700.600.500.100.900.25mKH2PO40.10.10.10.10.10.1混匀，37℃预热5min酶液0.10.10.10.10.10.1最终底物浓度246816037℃精确保温15min4按顺序各加1.0ml碱性溶液，1ml4-氨基安替吡啉，2ml铁氰化钾静置10minA510测出各管A510值，以底物浓度倒数为横坐标，作图，观察直线在纵轴和横轴上的交点位置并计算其Km值，于未加抑制剂时的Km值比较，说明该抑制剂属于何种类型。2结果与分析2.1酶的分离纯化将猪肝匀中加入正丁醇，经过滤后，滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化，获得较为纯净的碱性磷酸酶。分装在1ml的小管，一共10管，在-20℃的冰箱中保存。2.2Km的测定在Km的测定时，各管的吸光度如下：0.443、0.612、0.508、0.559、0.550、0.589、0.638由于，第二管测得的吸光度明显不对，所以，取后五管的吸光度的倒数作纵坐标，以后五管的作用物浓度的倒数为横坐标作图。根据数据作图如下：根据y=2.4182x+1.4598算出Km值，即y=0,x=-14598/24182=-1/Km所以，Km=1.6565。2.3碱性磷酸酶的最适pH及酸碱稳定性pH对酶活性的影响极为显著，通常各种酶只有在一定的范围内才表现出活性。pH对酶活性有很大影响，而且对酶的稳定性也有很大影响。在37℃的测活体系中，改变缓冲液的pH值,测各管的吸光度。以pH为横坐标，A510为纵坐标绘制pH--活性曲线，如图所示：根据数据及图可知本实验中碱性磷酸酶的最适PH为10.酶在过酸或过碱的条件下很容易变性失活，酸碱度对酶的稳定性有很大的影响。以pH为横坐标，A510为纵坐标，绘制酸碱稳定曲线，如图所示：根据实验数据和图可知pH为10的情况下该酶最稳定，pH过高或过低会影响酶的稳定性。2.4最适温度及热稳定性对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。温度对酶的作用具有双重影响，一方面与一般的化学反应一样，温度加速酶反应速度；另一方面该酶是蛋白质，温度加速酶蛋白的变性速度，因此，在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。酶反应速度达到最大值时的温度称为酶反应的最适温度。在不同温度条件下测定酶的活性，以反应温度为横坐标，A510为纵坐标，绘制温度----活性曲线图：根据数据和图可知37℃时，酶活性最高。将酶在25℃,37℃,80℃下处理，然后再在一定温度条件下测定酶活力。以处理温度为横座标，A510为纵坐标绘制热稳定曲线：观察图可知37℃时该酶稳定性最好。2.5抑制剂类型鉴别抑制剂是引起酶促反应速度降低的一类物质的统称。根据抑制剂与酶结合的特点可分为不可逆抑制剂和可逆抑制剂两种类型。在可逆抑制类型中，根据抑制剂、底物和酶三者的相互关系，又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合，即不能形成EIS，其动力学特征是：米氏常数的表观值K，m增加，酶的最大反应速度Vm不变。在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形成EIS，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特征是：Vm降低而Km不变。在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后才能和酶结合形成EIS，即Ki=∞，其动力学特征是；Km和Vm都发生了变化。本实验中KH2PO4作为碱性磷酸酶的抑制物。根据实验步骤进行操作可测得吸光度，以底物浓度倒数为横坐标，吸光度为纵坐标作图：根据y=4.1376x+1.1787算出Km值，即y=0,x=-11787/41376=-1/Km所以，Km=3.5103。根据Km值和实验指导上的三种抑制类型的图片，可以看出这个抑制剂是反竞争性抑制。3结果与讨论碱性磷酸酶分离纯化后应-20℃保存，应调好温度等条件，避免温度过高或过低影响酶的活性。采用猪肝提取碱性磷酸酶来测定其Km时，一般可稀释2-3倍，由于各实验室所用试剂等各种条件差异