测各种酶的方法

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资源描述

2.4.4可溶性蛋白质含量的测定样品提取:称取鲜样0.25—0.5g,用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,3000rpm离心10min,上清液备用。吸取样品提取液1.0mL(视蛋白质含量适当稀释),放入试管中(每个样品重复2次),加入5mL考马斯亮蓝试剂,摇匀,放置2min后在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查的蛋白质的含量。结果计算:样品蛋白质的含量=CV1/1000V2W(mg/g)式中:C—查标准曲线值,μg;V1—提取液总体积,mL;W—样品鲜重,g;V2—测定时加样量,mL。2.4.5总膳食纤维含量的测定分别称取葛根样品0.2g于烧杯中,将烧杯置冷水浴中,加入60%H2SO460mL,消化30min,然后将消化好的纤维素溶液转入100mL容量瓶,并用60%H2SO4定容至刻度,摇匀后用布氏漏斗过滤于另一烧杯中。取上述滤液5mL放入100mL容量瓶中,在冷水浴上加蒸馏水稀释至刻度,摇匀。取稀释后的溶液2mL于具塞试管中,加入0.5mL2%蒽酮试剂,并沿管壁加5mL浓H2SO4,塞上塞子,摇匀,静置12min,然后在620nm波长下,求测吸光度。根据测得的吸光度按标准曲线求得的回归方程求出纤维素的量,然后按下式计算样品纤维素的含量:Y(%)=X×10-6×a×100/W式中:X-按回归方程计算出纤维素含量(μg);W-样品重(g);10-6-将μg换算成g的系数;a-样品稀释倍数;Y-样品中纤维素含量(%)。2.4.11块根SPS、SS、SSS和ADPGPPase活性的测定酶液提取:称取1.50g鲜块根,加入8mLHepes-NaOH缓冲液,冰浴研磨,转入离心管中,匀浆液在4℃10000rpm离心10min,上清液用来测定SS、SSS和ADPGPPase的活性。ADPGPPase活性测定:参照张振清(1985)、Douglas(1988)和Thomas等的方法,50μL酶液+A液(100μL5mMADPG+50μL50mMMgCl2+100μLHepes-NaOH缓冲液+50μL50mMDTT)→30oC保温10min→+100μL20mMPPi起始反应15min→沸水浴1min终止反应→冷却至30oC+500μLB液(100μL6mMNADP+50μL1.5IU的PGM+50μL5IU/mL的G-6-PDH+缓冲液0.3mL),总体积950μL,30oC反应10min→340nm比色。SS测定:参照Douglas(1988)的方法,反应体系(100μL)含有下列物质:50mMHepes-NaOH(pH7.5),10mMUDPG,100mM蔗糖及酶提取液。反应体系在30℃保温30min,然后沸水浴1min,终止反应。利用3,5二硝基水杨酸法测定反应生成的果糖含量。SSS活性的测定:参照梁建生等(1994)的方法,350μL反应介质(含50mMHepes-NaOH缓冲液,1.6mMADPG,15mMDTT,支链淀粉1mg,30oC保温5min+50μL酶液→30oC反应30min→100℃1min,冷却到30oC+200μL反应介质(内含50mMHepes-NaOH缓冲液,40mMPEP,100mMMgCl2,200mMKCl,2IU/mLPK),混匀→30oC反应20min→100oC1min+400μL反应介质(内含10mMGlucose,20mMMgCl2.6H2O,2mMNADP,1.4IU/mLHexokinase,0.35IU/mLG-6-PDH,50mMHepes-NaOH缓冲液)混匀→30oC反应10min,冷却后340nm下比色。SPS活性测定:参考中国科学院上海植物生理研究所、上海市植物生理学会主编《现代植物生理学实验指南》(1999),取1g预冷的叶片,去掉中脉,剪碎,加入4倍体积的缓冲液A(100mmlnol/L、PH=7.0的Tris-HCI,10mmoL/LMgCl2,2mmoL/LEDTA,2mmoL/L琉基乙醇,2%乙二醇),磨成匀浆倒入离心管,在12000r/min离心10min,取上清液进行酶活性测定。以上提取过程均在4℃下进行,在总体积0.5mL反应混合液中(含50mmoL/LPH=7.0Tris一HCl,10mmoL/LMgC12,3mmoL/LUDPG,10mmoL/LFru一6一P),最后加入0.3mL的酶液,30oC水浴30min后,加入0.2mmoL/LNaOH,沸水浴10min,流水冷却,加入0.8mL0.1%间苯二酚及2.8mL30%HCI,摇匀,80℃水浴10min,冷却后于480nm波长处比色。酶活力以蔗糖(mg)/[叶片鲜重(mg)•h]表示。ATP酶活性的测定参照陈季楚法[17]:30mmol/L的ATP钠盐溶液0.1mL、0.1mol/L的Tris-maleate缓冲液0.8mL(pH6.3),加入0.1mL酶液开始反应,30min后加1mL5%的TCA终止反应,2000×g离心10min,取上清液测无机磷,重复3次。

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