测酶活方法

整理文档很辛苦,赏杯茶钱您下走!

免费阅读已结束,点击下载阅读编辑剩下 ...

阅读已结束,您可以下载文档离线阅读编辑

资源描述

1.POD活性测定:称取组织1g放于研钵中,加5ml0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)在冰浴中研磨成匀浆。将匀浆全部转入离心管中,在3000rpm,4℃条件下离心10min,上清液为酶粗提液,4℃保存备用。取酶液100μL,加反应混合液1.2.9ml0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)2.1ml0.05mol/L愈创木酚溶液,0.05mol/L愈创木酚溶液,0.06207g愈创木酚定容10ml3.1.0ml2%H2O2,30%H2O2670μL,加水至10ml.在37℃水浴中混合均匀,于470nm处测定其吸光度,连续记录3min。以不加酶的反应混合液作对照,每30秒钟读一次数,以每分钟吸光度值变化值0.01为一个酶活单位。酶活计算:OD290。g-1.FW.h-1=OD变化值/材料鲜重/反应时间2.CAT活性测定:设置两个重复一个对照,测定体系包括1.0.2ml酶液、2.1.5ml磷酸缓冲液pH7.0、3.1ml蒸馏水,4.25℃预热后逐管加入300μL0.1mol/L的H2O2在240nm下测定吸光度,每隔1min读一次,共测3min,以1min内减少0.1的酶量为1个酶活单位。0.1mol/L的H2O2:30%H2O256.8μL加水至10ml.3.SOD活性的测定:采用改进的高灵敏度的氯化硝基氮兰四唑(NBT)光还原法测定SOD活性。每处理取3个小烧杯,分别加入3mLSOD反应液(参照附录B),A)0.lmol/LpH7.8磷酸缓冲液准确称取0.72gNa2HPO4·12H2O溶于20ml水中取18.3mL;准确称取0.312gNaH2PO4·2H2O溶于20mL水中取1.7mL,混合并定容至20mL。(B)104mmol/L的甲硫氨酸称取0.39g甲硫氨酸溶解并定容至25mL。(C)0.3mmol/L的NBT称取0.0025g氯化硝基氮兰四唑(NBT),溶解后定容于10mL。(D)0.8mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)准确称取0.01gEDTA,定容于25mL。(E)50μmol/L的核黄素称取0.0012g核黄素,定容于10mL容量瓶中。取A液8mL、B液2mL、C液4mL、D液2mL,共16mL混匀为SOD反应液。①再加入150μL的50μmol/L的核黄素和150μL粗酶液,在25℃,4000Lx光照20min后于黑暗中停止反应。另作一组不加酶液其它处理同前的作为空白对照,并以pH7.8磷酸缓冲液调零。在560nm下测定吸光度。计算公式:SOD的OD560值/g鲜重=(对照OD560-样品OD560)/0.5×60分别计算不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分比,作出二者相关曲线,找出抑制NBT50%光化学还原的酶液量(μl),定为一个酶活单位U,计算总酶活单位和酶的比活性。④MDA含量测定:取④中粗酶液1.5mL,加入2.5mL0.5%的硫代巴比妥酸(TBA,取0.5gTBA溶解于100mL20%三氯乙酸),在沸水浴中保温30min后,立即冷却,10000rpm离心20min,取上清液分别在450nm、532nm和600nm下测吸光度值(A),计算公式:MDA(μmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450。④PPO活性的测定:植物组织1g,用预冷的PH7.8(0.05M)磷酸缓冲液1ml,研磨,再加1ml缓冲液,倾入5ml离心管,于4度,10000rpm下离心20min,收集上清。反应体系为3ml0.2M邻苯二酚(用pH7.8磷酸缓冲液配制),1ml酶液,以灭活的酶液为空白对照,30度下水浴10min,立即用20%三氯乙酸中止反应。离心5000rpm10min,于495nm处测定其吸光值。④PAL活性的测定:pH8.8硼酸缓冲液(含15mmol/L巯基乙醇)和50mgPVP,反应液为:1.6mL0.1mol/L-1硼酸缓冲液(pH8.8,内含10mmol•L-1苯丙氨酸)加0.2mL酶液,37℃反应30m后,测290nm处的吸光值,以反应时间零作参比。A290变化0.01为一个酶活单位(U•h-1•g-1•mf)。活性=(OD值/0.01t)乘稀释倍数.

1 / 2
下载文档,编辑使用

©2015-2020 m.777doc.com 三七文档.

备案号:鲁ICP备2024069028号-1 客服联系 QQ:2149211541

×
保存成功