浙江大学生物化学丙实验报告34

实验报告课程名称：生物化学实验（丙）指导老师：方祥年成绩：__________________实验名称：蔗糖酶蛋白含量的测定、蔗糖酶活力测定及其分离纯化效果的评价同组学生姓名：金宇尊、鲍其琛、袁平、朱耀仁、蔡玉林一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的和要求1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法①学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；②掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量；③掌握分光光度计的使用方法。2、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法①掌握酶活力测定的基本原理和方法；②学习酶的比活力的计算。二、实验内容和原理1、Folin-酚测定法Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L。优点：简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。缺点：该反应受多种因素的干扰。2、蔗糖酶活力测定蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉试剂比色法，斐林试剂法等。专业：农业资源与环境姓名：李佳怡学号：3130100246日期：2015.5.26地点：生物实验中心310装订线本实验采用3.5－二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在520nm进行比色测定，求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。3、蔗糖酶活力单位(u)：蔗糖酶在室温(25℃）,pH4.5的条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需的酶量(ml)。4、蔗糖酶比活力的计算：酶的比活力——为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。比活力＝活力单位/mg蛋白三、实验材料与试剂1、实验材料蔗糖酶提取的各步分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。2、实验试剂①标准蛋白质溶液：0.5g/L牛血清白蛋白②Folin-酚试剂（甲试剂；乙试剂）③1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量180.16）；④0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5；⑤5％蔗糖溶液；⑥3,5－二硝基水杨酸试剂；甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。四、实验器材与仪器1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法①试管、试管架以及离心管（7ml）、离心管架；②移液管（1ml、2ml、5ml）；③微量移液枪（200μl,1000μl）及枪头;④可见光分光光度计及1cm玻璃比色皿；⑤恒温水浴箱(25℃）。2、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法①试管、试管架以及离心管（7ml)和离心管架；②移液管（1ml、2ml、10ml)；③微量移液枪（200μl,1000μl）及枪头;④恒温水浴（25℃、100℃）；⑤可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿；五、操作方法和实验步骤1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法①制备Folin-酚法蛋白质标准曲线取6支试管，编号1－6，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。②各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋白质含量较高，因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的蔗糖酶蛋白质含量以前，可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖酶蛋白质含量,A500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。取13支试管，编号1～13，按表2依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。注：加入Folin-酚乙试剂后，要迅速混匀（加一管混匀一管），使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。③绘制标准曲线并计算⑴绘制标准曲线：以光吸收值（A500nm）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg/L）为横坐标，在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。⑵计算：蔗糖酶提取分离纯化的样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ稀释溶液的光吸收值（A500nm），根据蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量，再进行样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量的计算。2、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法①标准曲线的制作按表3加操作，后以还原糖（mg数或μmol数）为横坐标，A520值为纵坐标，制作葡萄糖浓度－吸光值标准曲线。②蔗糖酶的酶活力测定按照表4加样，在520nm处测定吸光度。六、实验数据记录和处理表1试管号1234560.5g/L标准蛋白质溶液（ml）00.20.40.60.81蒸馏水（ml）10.80.60.40.20Folin-酚试剂甲（ml）555555混匀，在室温(25℃）下静置10minFolin-酚试剂乙（ml）0.50.50.50.50.50.5混匀，在室温下静置20minA500nm00.1360.2600.3720.4930.580表2样品空白I(稀释25倍)Ⅱ(稀释10倍)I(稀释5倍)Ⅳ(原液)编号12345678910111213样品液V(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.5水(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5Folin－酚甲试剂(ml)5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0混匀后，室温（25℃）放置10分钟Folin－酚乙试剂(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5混匀后，室温（25℃）放置20分钟A500nm00.1640.0900.1120.1030.2060.6430.0510.6611.4180.0750.2280.633表312345671g/L葡萄糖标准溶液（ml）0.000.200.300.400.500.600.70H2O（ml）2.01.801.701.601.501.401.303.5－二硝基水杨酸(ml)1.01.01.01.01.01.01.0将各管溶液混匀后，在100℃恒温水浴加热5分钟，取出立即用冷水冷却至室温H2O（ml）7777777将各管溶液混匀A52000.1280.0690.1370.4400.6430.815表4样品空白I(稀释200倍)Ⅱ(稀释100倍)I(稀释50倍)Ⅳ(稀释25倍)编号123456789101112130.2mol/L乙酸缓冲液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5H2O(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5蔗糖酶液(ml)00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.55％蔗糖溶液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5保温时间立即混匀后，室温（25℃）保温10分钟（准确）3.5－二硝基水杨酸试剂(ml)1111111111111在100℃恒温水浴中加热5分钟蒸馏水7777777777777混匀A520nm00.0250.3040.9780.0280.3491.7270.8662.02.00.0140.0300.223七、实验结果与分析1、蛋白质含量标准曲线由表2可得：由此得蛋白质含量标准曲线：（1）在做标准曲线和样品曲线时，均应在加入乙试剂后要迅速混匀（加一管混匀一管），使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前,以防出现错误的实验结果。（2）因为参照液蛋白质含量为0，所以标准曲线趋势线须过原点，即截距为零。所得R平方数为0.9944，较接近1，说明实验较为成功。（3）蛋白质标准曲线的微小偏差可能来自于加入试剂后的局部未混匀以及添加试剂时的微小损失等。2、样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量将表2中的数据带入上述蛋白质含量标准曲线，可计算得：编号123456标准蛋白质含（mg/L）015.3830.7746.1561.5476.92A500nm00.1360.2600.3720.4930.580编号12345678910111213稀释酶液蛋白质含量（mg）00.1350.0740.0920.0850.1690.5290.0420.5441.1670.0620.1880.521稀释酶液蛋白质量平均含量（mg/mL）02.70.370.1841.70.8451.0580.842.722.3341.244.091.042原酶液蛋白质平均含量（mg/mL）027.1212.019.826.37由表中数据可知，从样品I到样品IV，样品中蛋白质含量呈减少趋势，这说明，随着离心，乙醇沉淀，离子交换柱层析等纯化步骤的进行，杂蛋白在逐步被分离，蔗糖酶的含量在逐渐增多，即蔗糖酶的纯度在逐渐增高。3、葡萄糖标准曲线由表3处理可得编号1234567还原糖（mg）00.200.300.400.500.600.70A52000.1280.0690.1370.4400.6430.815由此得葡萄糖标准曲线（1）葡萄糖浓度-吸光值标准曲线的R平方为0.9953，跟1比较接近，说明我们在测定葡萄糖浓度-吸光值标准曲线的时候操作基本正确，没有出现较大的误差。微小误差的产生可能是在试剂转移或者反应时间方面有误差。（2）尽管1号试管本身也有一定值的吸光度，但是因为将1号试管作为参照，所以将其吸光度视为0.为保证理论的正确性，使趋势线经过原点。4、各步提取液酶活力测定将表4数据代入上述葡萄糖标准曲线可得编号12345678910111213稀释酶液葡萄糖含量（mg）00.0190.2370.7610.0220.2721.3450.6741.5571.5570.0110.0230.174稀释酶液葡萄糖含量（umol）00.1051.3164.2240.1221.5107.4663.7418.6428.6420.0610.1280.966蔗糖酶原液酶活力单位(u/mL)041.999131.600168.96024.40275.500149.320374.100216.0586.423.0501.6004.8305、蔗糖酶各步纯化样品的纯度比较体积(ml)蛋白浓度(mg/ml)总蛋白(mg)活力(u/ml)总活力（u）比活力u/mg样品129.827.12808.176114.1863402.7434.210样品226.812.01321.86883.0742226.3836.917样品315.29.82149.264225.5233427.95522.966样品49.76.3761.7893.16030.6520.496总体蛋白质呈下降趋势，