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实验报告课程名称：生物化学实验（丙）指导老师：方祥年成绩：__________________实验名称：蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE检测分析及蛋白质相对分子质量测定同组学生姓名：金宇尊、鲍其琛一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)的基本原理和操作方法2、蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE检测分析3、学习测定蛋白质相对分子质量(Mr)的方法二、实验内容和原理（1）实验内容1、SDS－PAGE凝胶制作；2、蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE电泳分离；3、洗脱测定并计算相对分子质量。（2）实验原理1、电泳是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即向着与其电荷相反的电极移动的现象。2、电泳法分离、检测蛋白质混合样品主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所产生的电泳迁移率的差别。3、区带电泳是样品物质在一惰性支持物上进行电泳,因电泳后，样品不同组分形成带状区间，故称区带电泳。4、聚丙烯酰胺凝胶（PAG)由丙烯酰胺和交联试剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在有催化剂（如过硫酸铵或核黄素）和增速剂（如N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，TEMED）的情况下聚合而成的。专业：农业资源与环境姓名：李佳怡学号：3130100246日期：2015.6.2地点：生物实验中心310装订线5、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，这主要是由蛋白质样品所带的电荷和分子质量的差异性进行分离；在电泳过程中仍保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性。6、聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为⑴连续系统凝胶缓冲液的pH值及凝胶浓度不变。该电泳系统具有电荷效应、分子筛效应；⑵不连续系统凝胶缓冲离子成分、pH值、凝胶浓度、电位梯度不连续，由浓缩胶和分离胶组成。由于浓缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品（即使是稀释样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。该电泳系统具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。7、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以PAG为支持物的电泳，由于各种蛋白质所带静电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。为消除静电荷对迁移率的影响，在整个电泳体系中加入一定量的阴离子去污剂“十二烷基硫酸钠（简称SDS）”和“强还原剂（巯基乙醇）”后，蛋白质样品就会与SDS结合形成带负电荷复合物，而SDS作为一种变性剂和助溶剂，它能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键，并结合到蛋白质分子上，使分子去折叠，破坏蛋白质分子内的二级和三级结构，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。另外，SDS－蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，可打开蛋白质分子内或肽链间的二硫键，并能避免重新氧化，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。蛋白质亚基的电泳的迁移率主要取决于亚基的相对分子质量大小，而电荷的因素可以忽略。8、蛋白质亚基相对分子质量的测方法在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质－SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只主要取决于它的椭圆棒的长度即蛋白质的相对分子质量的大小，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。由于蛋白质的相对分子质量不同，所形成复合物的相对分子质量不同，在电泳中反映出不同的迁移率。当蛋白质或亚基的相对分子质量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈直线关系，符合下列方程式：lgMr=K－bRf式中Mr代表相对分子质量，K代表常数，b代表斜率，Rf代表迁移率。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得蛋白质相对分子质量。三、实验材料与试剂1、实验材料蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）2、实验试剂(1)30.8%凝胶贮液：丙烯酰胺(Acr)30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加水溶解，并加水定容到100ml，贮于棕色瓶，4℃保存。(2)分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HClpH8.9(3)浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris-HClpH6.7(4)10%SDS(5)TEMED(N,N,N′,N′－四甲基乙二胺）(增速剂）(6)10%过硫酸铵（引发剂）(7)电泳缓冲液（pH8.3）：Tris6g，甘氨酸28.8g，SDS2g，用蒸馏水溶解并定至1000ml，使用时稀释1倍。(8)蛋白质样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LTris-HClpH8.0缓冲液。(9)染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250，加90.8mL50%甲醇，加9.2mL乙酸，溶解混匀后使用。(10)脱色液：75ml乙酸，50ml甲醇，加蒸馏水875ml，混匀使用。(11)蛋白质分子量标准溶液：①β-半乳糖苷酶（MW116,000），②牛血清白蛋白(MW66,200)，③卵清蛋白（MW45,000），④乳酸脱氢酶（MW35,000），⑤限制性内切酶Bsp981（MW25，000），⑥β-乳球蛋白（MW18,400），⑦鸡蛋清溶菌酶（MW14,400）。四、实验器材与仪器1、电泳仪、垂直电泳槽及制胶配件；2、微量移液器（枪）：1000μl、200μl、20μl及相应的枪头（1套/2组）；3、烧杯50ml×2、100ml×2,长滴管×2支（一套/组）；4、微量注射器50μl（每组一把）；5、恒温水浴或干式恒温加热器(100℃)（1～2台）；6、高速台式离心机（1.5ml）（1～2台）；7、离心管（1.5ml×5个）及离心管架×1（一套/组）；8、￠15cm培养皿（染色、脱色用）（一套/组）；9、脱色摇床（染色、脱色用）。五、操作方法和实验步骤1、准备电泳装置：电泳仪、电泳槽和制胶模具。2、配胶及凝胶的制备⑴配制凝胶：不连续体系SDS－聚丙烯酰胺凝胶配制12%分离胶所需试剂量(ml)5%浓缩胶所需试剂量(ml)30.8%凝胶贮液6.001.703mol/LTris-HCLpH8.9分离胶缓冲液3.800.5mol/LTris-HCLpH6.7浓缩胶缓冲液1.2610%SDS0.150.10TEMED0.010.01蒸馏水4.946.9010%Ap0.100.05总体积(ml)15.0010.00⑵凝胶制备①分离胶的制备：按上表配制15ml分离胶，混合均匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内→用少许蒸馏水（或水饱和的异丙醇或正丁醇）沿长玻璃板板壁缓慢注入，约5mm高（封住胶面，以促使聚合并使胶面平直)→约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合，倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余的水分。②浓缩胶的制备：按上表配制10ml浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩液加到已聚合的分离胶上方，直至离短玻璃板上得约0.5cm处→轻轻将样品槽模板（梳子）插入浓缩胶内，约30min后凝胶聚合，并使凝胶“老化”→小心拔去样品槽的槽板（梳子），用滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，电泳缓冲液应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。3、样品处理与加样⑴样品制备取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）10000r/min离心30s，取上清液各50ul（样品浓度调整至2～5mg/ml)，分别放入1.5ml离心管中，10000r/min离心1min,收集上清为样品溶液。⑵样品处理将样品溶液分别按等体积加入“2×蛋白质样品溶解液”，100℃保温3分钟，取出冷却后，10000r/min离心1min,取上清直接加样。⑶加样①样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ：用微量注射器吸取10～20μl样品，注入对应的凝胶加样孔内(每孔蔗糖酶样品上样量在20～40μg）。如样品浓度较低，可适当增加上样量。②蛋白质Marker:用微量注射器吸取蛋白质标准分子量溶液10μl加入/孔。4、电泳在电泳槽中加入电泳缓冲液，上槽（加样孔端）接负极、下槽接正极，接电泳仪电源，电流控制在2～3mA/样品孔，一般样品进浓缩胶前，电流控制在10～20mA，待样品进分离胶后，将电流调到20～30mA，保持电流强度不变（恒流），待指示染料迁移至下沿约0.5～1cm处停止电泳。5、剥胶、固定和染色电泳结束后，取下凝胶膜→用专用铲子撬开短玻璃板→将凝胶一角切下做一加样标记→将凝胶板放在￠15cm培养皿内，加入染色液，固定、染色15min左右，6、脱色弃去染色液，加入蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰为止。六、实验数据记录和处理1、实验现象：制胶过程：将分离胶和水注入后，30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线；样品制备：离心后——溶液淡黄色，下层有部分沉淀凝胶板图：如图所示：左1为Marker，右1、3、4、5分别为样品1、2、3、4，右2为样品1溢出导致，由于加样较少，导致实验所得蛋白质区带颜色较浅。所有样品带均清晰明显，则取样品Ⅳ值。2、实验数据记录①计算蛋白质样品相对分子质量迁移率计算：相对迁移率Rf＝蛋白样品距加样端距离(cm)/溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)列出电泳后各种蛋白质的迁移率和分子量。作图法求相对分子质量：以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子质量lgM为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。根据蛋白质样品的相对迁移率可直接在标准曲线上查出其相对分子质量（lgMr=K－bRf），求蛋白质样品相对分子质量（Mr)3、作标准蛋白质相对分子量的对数与电泳相对迁移率标准曲线图选取加样端为起点，计算标准样的各个条带的比移值如下：标准蛋白分子量KDa1801309572554334261710迁移距离cm2.702.803.053.303.754.204.705.306.557.75染料迁移距离cm8.80迁移率Rf0.3070.3180.3470.3750.4260.4770.5340.6020.7440.881蔗糖酶样品4迁距离4.58cm标准曲线数据表标准蛋白质分子量(KDa)lgMr相对迁移率1805.260.3071305.110.318954.950.347724.860.375554.740.426434.630.477344.530.534264.410.602174.230.744104.000.881得到标准蛋白质相对分子量的对数与电泳相对迁移率标准曲线图因电泳迁移率与相对分子质量的对数呈直线关系，符合下列方程式：lgMr=K－bRf由有图表可得：K=5.6673；b=1.9862，R2=0.9397。y=-1.9862x+5.6673七、实验结果与分析1、SDS-PAGE图谱：2、标准蛋白质相对分子量的对数与电泳相对迁移率标准曲线图3、计算蛋白质样品相对分子质量由样品Ⅳ中蔗糖酶Rf=（4.58/8.80)=0.52，代入线性方程知lgMr=4.63，所以Mr=42658。分析：在凝胶电泳图中，样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和标准样依次在由右向左的第1、3、4、5、10加样孔中，第2个孔为污染。由于加样量较少，颜色较浅。但每个样品都存在许多杂带，表明样品中仍有许多杂蛋白。这是由于在离子交换柱层析分离的时候，杂质蛋白分子量较小，且可能带电与蔗糖酶相近，所以在洗脱的时候有一部分随蔗糖酶一起被洗脱。八、讨论、心得1、在进行凝胶电泳测定蛋白质分子量时，前期最主要的就是制胶。制胶可以在准备倒胶的时候再加AP，防止胶液过早凝固，可以有较多的时间处理突发状况。2、在倒胶时可以先倒一部分的胶，一方面可以检测有无漏胶，另一方面可以想