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实验报告课程名称：生物化学实验（丙）指导老师：方祥年成绩：__________________实验名称：质粒DNA的微量制备及电泳检测同组学生姓名：金宇尊、鲍其琛一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习并掌握质粒DNA的提取原理和方法；2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析。二、实验内容和原理1、实验内容①质粒DNA的提取②DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定2、实验原理①质粒：质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA分子，大小在1-200kb之间，具有自主复制和转录功能,能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。②从细菌细胞中抽提质粒DNA的步骤：a细菌培养使质粒大量扩增；b收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA；c进一步除去蛋白、脂类、RNA等杂质，分离和纯化质粒DNA。③碱裂解法来分离纯化质粒DNA：在EDTA存在下，经过SDS处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH），使核质体DNA与质粒DNA的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA与质粒DNA又存在复性的差异，质粒DNA很快得以复性，而细菌核质体DNA分子难以复性，核质体DNA会缠绕附着在细专业：农业资源与环境姓名：李佳怡学号：3130100246日期：2015.6.9地点：生物实验中心310装订线胞膜碎片上通过离心被沉淀下来，质粒DNA则留在上清液内；上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA以及脂质类杂质等，可通过碱性酚-氯仿-异戊醇混合液的抽提去除；含有质粒DNA的上清液用无水乙醇或异戊醇沉淀，这是由于当加入无水乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。获得较纯的质粒DNA。④DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在碱性溶液中（pH8.3缓冲液）带负电荷，它在电场作用下向正极泳动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同，并能区分出不同的区带。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。⑤影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有：DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分子量越大，迁移率越小。DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA。胶浓度的影响：浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为1％～2％；电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm）（电场强度）。而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。碱基组成与电泳温度的影响:一般影响不大。⑥质粒DNA不同构型在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速度：环形双链DNA分子有三种构型。第一种是共价闭合环状DNA，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型，迁移速度最快；第二种是开环DNA，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口两条核苷酸链中只有一条保持完整的环形结构，即OC构型，迁移速度最慢；第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状,通称L构型。这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。⑦实验有关试剂的作用：溶液Ⅰ：葡萄糖：增加溶液的黏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA。EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。Tris·HCl：使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。溶液Ⅱ：SDS：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。溶液Ⅲ：中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。高盐的3mol/LNaAc/KAc有利于变性的大分子核质体DNA以及K/Na离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。酚：一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。氯仿：有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。乙醇或异丙醇——可以沉淀核酸，当加入乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。70％的乙醇——用于洗涤核酸沉淀，其目的是去除盐及挥发性较小的异丙醇。RNaseA——用于消化质粒DNA溶液中的残余RNA。三、实验材料与试剂1、实验材料含重组质粒菌种2、实验试剂⑴LB液体培养基⑵氨苄青霉素：100mg/ml⑶溶液Ⅰ⑷溶液Ⅱ⑸溶液Ⅲ⑹酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）⑺无水乙醇⑻70%乙醇⑼TE缓冲液（pH8.0）⑽RNaseA（1mg/ml）⑾0.5×TBE缓冲液（pH8.0）⑿琼脂糖⒀6×加样缓冲液⒁1mg/ml溴化乙锭（EB）四、实验器材与仪器1、恒温培养箱37℃；2、恒温摇床37℃；3、高压灭菌锅；4、超净工作台；5、台式离心机；6、振荡器；7、微量移液枪(10，20，200，1000ul)；8、枪头（10，20，1000ul）及枪头盒；9、离心管1.5ml及离心管架；10、制冰机；11、冰箱；12、干式恒温器37℃、50℃；13、微波炉；14、电泳仪及；15、电泳槽；16、紫外检测仪。五、实验操作方法和步骤1、收集细菌,碱裂解液提取质粒DNA，纯化质粒DNA①去除核DNA，粗提取质粒DNA离心：取1.2ml的过夜培养菌液加入1.5ml离心管中，8000r/min离心1min；弃上清液，将管倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽。冰浴：将菌体沉淀加100ul溶液Ⅰ，振荡悬浮菌体，冰浴放置5～10min。再离心：加200ul溶液Ⅱ，盖紧管盖，快速温和颠倒离心管数次，确保离心管内溶液混匀使之变清，冰浴10min。加150ul溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒数次使之混匀，冰浴放置5min。（说明：以上步骤目的）②去除可溶性杂蛋白等杂质，纯化质粒DNA离心：12000r/min离心10min，将上清液转至另一干净离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），振荡混匀，12000r/min离心10min。冰浴：上清液移入另一干净离心管中，加入2倍体积无水乙醇，混匀后置-20℃冰箱中20min。离心：12000r/min离心10min，弃上清液，将溶液管口倒置吸水纸上，使液体尽可能流尽。③去除核RNA加样：加入1ml70﹪乙醇洗沉淀一次（动作要轻），弃70﹪乙醇溶液，将管口倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽，自然干燥或50℃干燥。保存：将沉淀溶于50ulTE缓冲液（pH8.0，含20mg/LRNaseA）中，置37℃恒温器中保温30min后，取质粒DNA样液做琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余纯化的质粒DNA样品置于-20℃保存备用。2、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定①加样：取5ul纯化的质粒DNA样品，与1ul6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。（注：a勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡；b上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿；c每加完一个样品要换枪头以防互相污染。）②电泳：加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需30～60min）。③观察和拍照：取出胶块置于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察。六、实验数据记录和处理1、样品离心后：上层淡黄色，下层有乳黄色沉淀；2、加入溶液Ⅰ后：沉淀溶解，溶液呈淡黄色；3、加入溶液Ⅱ后：溶液无色澄清；4、冰浴后：部分凝固，呈现无色；5、加入溶液Ⅲ后：有白色絮状沉淀出现；6、离心后：溶液分层，沉淀白色，有部分粉末悬浮；7、加酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）后：分层，下层颜色土黄色，上层淡黄色；8、离心后：分层，上层无色透明，下层淡黄色，中层杂蛋白油状。七、实验结果与分析电泳图谱：1、实验结果：①第一条带对应的DNA为超螺旋构型DNA，条带最亮，表明此结构的DNA含量最高，同时其迁移距离最远，在同样时间内，超螺旋构型DNA迁移速度最快，结果正常。②第二条带对应的DNA为线状DNA，在三条带中颜色最浅，含量最少。③第三条带对应的DNA，为开环DNA，迁移速度最慢，含量较线状DNA微多一些。④点样孔处有较多DNA残留，表明加样时有较多溢出，操作不够规范，仍需改进。⑤在第一条带之前无其它可辨的条带，可推测无RNA残留。2、结果分析：根据实验结果得出如下分析：①在加样时，未控制好位置和高度，导致残留在点样孔中的样品较多，因此也影响了各个条带中的样品量，若在加样时操作规范，则可增大条带中DNA的量。②各个条带之间距离较大，表明超螺旋构型DNA、线状DNA、开环DNA三种不同类型的DNA之间分离较好，且超螺旋型DNA亮度最亮，表明其含量最多。③但仍存在较多开环和线状DNA含量也较多，表明提取到的DNA杂质较多，原因可能为没有在洗涤沉淀时进行充分洗涤，只是稍微放置一会后就将乙醇倒掉了，应多放置一段时间，并微微摇动，以除去杂质。④由于在第一条带之上不再有其它可辨的条带，可推测无RNA残留。说明DNA纯度高，提取过程对RNA的去除完全。八、讨论、心得思考题：1、在提取质粒DNA的过程中，EDTA、SDS、NaOH、乙酸钾、酚-氯仿-异戊醇等试剂的作用是什么？EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。SDS：：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。乙酸钾：质粒DNA复性。酚-氯仿-异戊醇：酚：一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。氯仿：有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡（泡沫）。其余试剂见实验原理部分。2、在质粒DNA的提取过程中，应注意哪些操作，为什么？（1）各步骤中的混匀过程要温和，因为质粒DNA是环状生物大分子，若是过于剧烈，极易收集到破碎、断裂的片段而不是完整的超螺旋DNA；（2）各步骤中的试剂的量要适当，过量和不足都会影响实验结果。（3）提取过程中应尽量保持较低温度。（4）加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。3、琼脂糖凝胶电泳操作应注意哪些环节？（1）倒胶时把握好胶的温度，不要高于60ºC，否则温度太高会使制胶板变形。（2）胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要