福建农林大学分子生物学教案

1教案2005~2006学年第一学期学院、系室生命科学学院生物技术系课程名称生物化学与分子生物学实验专业、年级、班级2002级生物科学、生物技术2003级生物技术（专升本）主讲教师甘纯玑、李今煜、谢苗、沙莉2实验酵母ＲＮＡ的提取与分离实验大蒜细胞ＳＯＤ的提取与分离实验SDS-PAGEＥ电泳实验凝胶排阻层析实验多糖的水解及水解物的薄层层析测定实验菜花（花椰菜）中核酸的分离和鉴定实验质粒DNA的提取及酶切实验琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验PCR基因扩增实验探针制备实验Southern杂交3福建农林大学教案编写说明教案又称课时授课计划,是任课教师的教学实施方案。任课教师应遵循专业教学计划制订的培养目标，以教学大纲为依据，在熟悉教材、了解学生的基础上，结合教学实践经验，提前编写设计好每门课程每个章、节或主题的全部教学活动。教案可以按每堂课（指同一主题连续1~4节课）设计编写。教案编写说明如下：1、编号：按施教的顺序标明序号。2、教学课型表示所授课程的类型，请在理论课、实验课、习题课、实践课及其它栏内选择打“√”。3、题目：标明章、节或主题。4、教学内容：是授课的核心。将授课的内容按逻辑层次，有序设计编排，必要时标以“*”、“#”“？”符号分别表示重点、难点或疑点。5、教学方式、手段既教学方法，如讲授、讨论、示教、指导等。教学媒介指教科书、板书、多媒体、模型、标本、挂图、音像等教学工具。6、讨论、思考题和作业：提出若干问题以供讨论，或作为课后复习时思考，亦可要求学生作为作业来完成，以供考核之用。7、参考书目：列出参考书籍、有关资料。8、日期的填写系指本堂课授课的时间。4福建农林大学教案编号：课时安排：8学时教学课型：理论课√实验课□习题课□实践课□其它□题目（教学章、节或主题）：理论讲授、学生预习实验、实验预习报告面批教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：掌握实验准备的基本步骤熟悉实验操作步骤掌握实验中需要溶液的配制熟悉实验内容教学内容（注明：*重点#难点？疑点）：（*）实验室规则——→实验室安全及防护知识——→（*）实验预习、实验记录与实验报告——→实验室基本操作——→（#）缓冲溶液与pH测定——→生化实验室的基本设施与装备5教学方式、手段、媒介：讲授板书设计：1.1实验室规则1.2实验预习、实验记录与实验报告格式1.3实验室安全及防护知识1.4缓冲溶液与pH测定1.5实验室基本操作1.6生物化学与分子生物学实验室的基本设施介绍讨论、思考题、作业：预习下周安排的实验参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社，2001年版周先碗，胡晓倩编，生物化学仪器分析与实验技术，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：甘纯玑李今煜谢苗沙莉职称：教授讲师讲师助教2005年11月05日6福建农林大学教案编号：课时安排：8学时教学课型：理论课□实验课√习题课□实践课□其它□题目（教学章、节或主题）：实验酵母ＲＮＡ的提取与分离教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：掌握冷冻离心机的使用掌握缓冲液的配制熟悉RNA的特性反应及苯酚－乙醇提取法做好实验记录教学内容（注明：*重点#难点？疑点）：原理酵母细胞置于含有ＳＤＳ的缓冲液中，加等体积的苯酚水溶液，通过激烈振荡一段时间，将ＲＮＡ和蛋白质分开，然后离心分层，ＲＮＡ溶于上层水溶液中，ＤＮＡ和蛋白质在酚层，ＲＮＡ可用乙醇沉淀析出。步骤1、取５０ｇ新鲜湿酶母或8g干酵母，加入50ｍｌＳＤＳ一Ｔｒｉｓ缓冲液，再加入75ｍ１９０％苯酚水溶液，在室温下激烈振荡１ｈ，然后冷却至０～４℃，以下操作均在０～４℃进行。2、上述提取液以４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，分离出上层水相，加入１／１０体积的乙酸钾溶液，再加入２倍体积的９５％乙醇。在一１６℃左右放置使ＲＮＡ沉淀析出。此沉淀可在冰箱中（０－４℃）长期保存。亦可将沉淀以４０００ｒ／ｍｉｎ离心10ｍｉｎ，取沉淀用少许３５％乙醇、９５％醇和无水乙醇各离心洗涤一次，然后将沉淀溶于少量１ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液中，４℃保存备用(或真空干燥)。3、ＲＮＡ含量测定教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导7板书设计：讨论、思考题、作业：完成实验报告参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社，2001年版周先碗，胡晓倩编，生物化学仪器分析与实验技术，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：甘纯玑李今煜谢苗沙莉职称：教授讲师讲师助教2005年月日8福建农林大学教案编号：课时安排：8学时教学课型：理论课□实验课√习题课□实践课□其它□题目（教学章、节或主题）：实验大蒜细胞ＳＯＤ的提取与分离教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：掌握冷冻离心机的使用掌握缓冲液的配制掌握研磨等基本操作熟悉SOD酶的一种提取法做好实验记录教学内容（注明：*重点#难点？疑点）：原理：超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（Ｏ２－）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：２０２－＋Ｈ２＝Ｏ２＋Ｈ２０２。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的ＳＯＤ，通过组织或细胞破碎后，可用ｐＨ７.８磷酸缓冲液提取。由于ＳＯＤ不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。步骤：1、组织或细胞破碎称取５ｇ左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。2、ＳＯＤ的提取将上述破碎的组织或细胞，加入２～３倍体积的0.05mol／Ｌ，ｐＨ7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使ＳＯＤ充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000ｒ／min下，离心15min，弃沉淀，得提取液。3、除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿－乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。4、ＳＯＤ的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r／min离心15min，得ＳＯＤ沉淀。将ＳＯＤ沉淀溶于0.05mol／Ｌ，pＨ7.8的磷酸缓冲液中，于55～60℃热处理15min，离心弃沉淀，得到ＳＯＤ酶液。将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的ＳＯＤ活力。5、ＳＯＤ活力测定取３根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。试剂空白管对照管样品管碳酸缓冲液５．０５．０５．０ＥＤＴＡ溶液０．５０．５０．５蒸馏水０．５０．５－9样品液－－０．５混合均匀肾上腺素液－．５０．５在加入肾上腺素前，充分摇匀并在３０℃水浴中预热５ｍｉｎ至恒温。加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应２ｍｉｎ，然后立即测定各管在４８０ｎｍ处的光密度。对照管与样品管的光密度值分别为Ａ和Ｂ。在上述条件下，ＳＯＤ抑制肾上腺素自氧化的５０％所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：酶活力（单位）＝２·(A－B)·N/A式中N——样品稀释倍数;２——抑制肾上腺素自氧化５０％的换算系数（100％/50％）。若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算酶活力单位/ml=[2·(A－B)·N/A][V/V1]=26·(A－B)·N/A式中V——反应液体积（6.５ｍｌ);V1——样品液体积（0.５ｍｌ）。最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化过程收率。教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导板书设计：讨论、思考题、作业：完成实验报告参考书目：杨安钢，毛积芳，药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社，2001年版周先碗，胡晓倩编，生物化学仪器分析与实验技术，化学工业出版社，2003年版苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年教师姓名：甘纯玑李今煜谢苗沙莉职称：教授讲师讲师助教2005年月日10福建农林大学教案编号：课时安排：8学时教学课型：理论课□实验课√习题课□实践课□其它□题目（教学章、节或主题）：实验SDS-PAGEＥ电泳教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：掌握SDS-PAGE的操作掌握电泳测定蛋白质分子量的方法掌握凝胶电泳中各种试剂的作用教学内容（注明：*重点#难点？疑点）：原理：SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。操作过程：1、准备步骤1）将凝胶板依次用水、SDS、水、无水乙醇、水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。2）试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。3）灭菌枪头、eppendorf管。2、制备凝胶1）安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中，以5%琼脂封底。2）配制10%的分离胶（20ml）：依次将8ml蒸馏水，6.7ml30%丙烯酰胺贮存液，5ml1.5mol/LTris（pH8.8）溶液，0.2ml10%SDS溶液，0.2ml10%过硫酸铵，0.008mlTEMED混合，立即灌胶。3）迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。小心在胶上覆盖一薄层正丁醇。4）在分离胶聚合的过程（约40分钟）中，配制5%的积层胶（8ml）：依次混合5.5ml蒸馏水，1.3ml30%丙烯酰胺贮存液，1.0ml1.0mol/LTris（pH6.8）溶液，0.08ml10%SDS溶液，0.08ml10%过硫酸铵，0.008TEMED。TEMED应在灌胶前才加入。5）分离胶聚合完全后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。6）灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。7）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯11酰胺。8）在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。3、样品的制备在蛋白溶液中加入等体积的2×样品溶解液，使蛋白的终浓度为3-4mg/ml，混合液在沸水浴中加热3分钟，冷却后即可上样。4、上样用微量进样器上样，每加入一种样品，应在下槽中洗涤加样器数次，最后在空白加样孔中加入等体积的SDS样品溶解液。5、电泳装好冷凝水系统，打开电源，初始电压为100-120V，当染料进入分离胶（这段时间约为20min）后，将电压提高到200-220V，继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。6、后处理1）固定：从电泳装置上卸下玻璃板，用镊子小心撬开玻璃板，除去积层胶部分，将分离胶移入固定液（固定液的量至少为胶体积的5倍）中固定，直至染料由蓝绿色变为黄色。2）染色：除去固定液，加入染色液（用量同上），室温染色8小时或60℃染色2小时。3）脱色：回收染色液，将凝胶浸泡于脱色液中，直至背景脱至无色，其间更换脱色液3-4次。结果绘制蛋白图谱，并对其进行必要说明。注意事项N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示