离体培养液蔗糖浓度对水稻籽粒蔗糖合成酶活性的影响

离体培养液蔗糖浓度对水稻籽粒蔗糖合成酶活性的影响植物学专题讨论之二导师：粱建生教授报告人：王玉霞2005年12月20日前言蔗糖合成酶的作用：蔗糖+UDP果糖＋UDPG一、试验设置1.材料与方法1.1供试材料供试品种为具较高结实率的超级稻两优培九。2004年种植于扬州大学农学院试验田，单本植，田间管理一致，同一般大田栽培。始穗期选择生育进程和长势长相基本一致的主茎进行标记,待稻穗穗颈节露出剑叶鞘1～2ｄ,取样进行穗培养1.2水稻穗离体培养在无菌室中,先用体积分数为1%次氯酸钠溶液对单茎穗穗颈节以下部分进行表面消毒,在无菌水中剪去距穗颈节11～12ｃｍ以下部分,然后在超净工作台将单茎穗转移到盛有50ｍＬ培养液的玻璃管中,用无菌医用棉封口。每处理重复6次。无菌室用紫外线消毒,进入无菌室的器具、玻璃管、医用棉等都经高温高压或φ=70%酒精消毒。基本培养基成分包括MS无机盐和VB5有机成分，蔗糖浓度依试验处理定。培养玻璃管用铝箔包裹，在暗中培养，穗培室温度24～25℃。（1）不同浓度的蔗糖溶液处理0、50、100、150、200mM（2）不同时间的蔗糖溶液处理12、24、48h（3）不同渗透性溶液处理Mit、Sit、KCl100mM（4）相同浓度的己糖溶液处理Glu、Fru、Glu+Fru100mM（5）己糖激酶抑制剂处理NAG（6）糖类似物溶液处理Man、3-O-MG1.3试验处理2.试验方法2.1蔗糖、可溶性总糖的测定2.2蔗糖合成酶活性的测定10ml80%乙醇80C水浴30min冷却残渣10ml80%乙醇80C水浴30min2000rpm离心15min冷却2000rpm离心15min残渣10ml80%乙醇80C水浴30min冷却2000rpm离心15min残渣合并三次上清液0.1克干样定容至100ml蔗糖测定可溶性总糖测定吸0.9ml提取液吸1.0ml提取液0.1ml2NNaOH1.0ml水沸水浴10min4ml0.2%蒽酮冷却15min沸水浴1ml0.1%间苯二酚3ml10NHCl80C水浴60min冷却比色OD500冷却比色OD620酶的提取均在0-4℃低温下进行。取20粒-86℃冰箱贮存的籽粒，剥壳去胚后，籽粒加1.5ml提取介质快速研磨12,000rpm离心15min，取上清夜作为粗酶液。酶的提取介质为：100mmol/LHepes/KOH(pH7.5),5mmol/LMgCl2,5mmol/LDTT,20mmol/L巯基乙醇,10mmol/L抗坏血酸，2mmol/LEDTA，1%(w/v)PVP。酶的反应介质为：0.2ml的反应介质中含有50mmol/LHepes/KOH(pH7.5),5mmol/LMgcl2,3mmol/LUDPG,15mmol/L果糖，一定量的酶液。酶的活性测定过程参照Roe（1934）的方法，混合物30℃反应30分钟2mol/LNaOH溶液终止反应，用间苯二酚测定生成的蔗糖的量。酶活力单位为µmol蔗糖/mg蛋白·分钟。蛋白质含量测定：蛋白质的测定用Bradford(1976)方法，以BSA为标准蛋白。二、结果与分析1.不同浓度的蔗糖处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响Sucrosecontent(mg.g-1DW)20406080020406080Solubletotalsugarcontent(mg.g-1DW)050100150200FeedingSolutionSucroseConcentration(mM)FeedingSolutionSucroseConcentration(mM)050100150200250SucroseSynthaseActivity(mol.mg-1pro.min-1).2.4.6.81.0由图可见，在介质蔗糖浓度为100mM范围内，蔗糖合成酶活性随蔗糖浓度的提高而提高，当蔗糖浓度为150mM时略有下降，之后又再升高。Fig.1.CarbohydratecontentsandSuSyactivityinthegrainsofrice.Excisedricepanicleswerefedwithsolutioncontainingtheindicatedconcentrationsofsucrose(0-200mM).2.不同时间的蔗糖处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响Sucrosecontent(mg.g-1DW)20406080100120H2O100mMSucroseTreatmentPeriod(h)Solubletotalsugarcontent(mg.g-1DW)20406080100120244812TreatmentPeriod(h)SucroseSynthaseActivity(mol.mg-1pro.min-1).2.4.6.8H2O100mMSucrose244812Fig.2.CarbohydratecontentsandSuSyactivityinthericegrainsfromexcisedricepaniclestreatedinH2Oorin100mMsucrosefor12,24,48h.由图可见，蔗糖加入后促进了蔗糖合成酶活性的提高。这种效应在12小时时很明显，24小时达到峰值，之后开始下降。3.不同渗透性糖对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响Table1.EffectofvariousosmoticallyactivysugarsonSuSyactivityinricegrainfromexcisedricepaniclesthatwereculturedfor24hinwater,sucrose,Kcl,mannitol,orsoribitol.由表1看出，用Kcl、甘露醇、山梨醇作为糖介质培养离体穗24小时，在百粒重、蔗糖含量、总糖含量及蔗糖合成酶活性与对照差异不大，这说明蔗糖对籽粒发育以及蔗糖合成酶活性的调节不是因为渗透压的影响。4.己糖和抑制剂处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响Exp.TreatmentSolutionDWg.百粒-1Sucrosecontentmg.g-1DWTotalsugarcontentmg.g-1DWSuSyactivityµmol.mg-1pro.min-1ABWaterSucrose(100mM)Glucose(100mM)Fructose(100mM)Glucose+FructoseWaterNAG(10mM)Sucrose(100mM)NAG+SucroseGlucose(100mM)NAG+GlucoseFructose(100mM)NAG+Fructose0.6430±0.0020.7643±0.0010.8480±9.0e-40.6637±6.0e-40.6667±0.0010.6430±0.0020.6037±0.0010.7643±0.0010.6593±9.0e-40.8480±9.0e-40.6980±0.0170.6637±6.0e-40.7437±0.01517.4016±1.2150.9817±0.5519.3778±0.3921.8184±0.3422.8916±0.6117.4016±1.2118.1658±0.8750.9817±0.5526.6147±0.5119.3778±0.3934.6758±0.9021.8184±0.3451.5734±0.7522.8938±2.9562.0613±1.6833.4441±2.9843.9076±2.9442.9306±1.4722.8938±2.9528.5172±1.5162.0613±1.6851.4467±3.2933.4441±2.9835.1853±1.4243.9076±2.9452.5298±4.930.3283±0.020.6550±0.030.4810±7.0e-30.5068±0.010.5253±0.040.3283±0.020.4232±0.030.6550±0.030.4574±0.020.4810±7.0e-30.4021±0.020.5068±0.010.5427±0.02NAG:N-acetyl-glucosamine,aninhibitorofhexokinase(HXK);SuSy:SucrosesynthaseTable2.EffectofhexosesandNAGonSuSyactivity.InexperimentA,excisedricepanicleswerefedwater,100mMsucrose,100mMglucose,100mMfructose,or100mMglucoseplus100mMfructosefor24h.InexperimentB,excisedricepanicleswerefedwateror100mMsucrose,glucose,fructoseinthepresenceorabsenceof10mMNAGfor24h.由表2可见，等摩尔浓度的己糖处理后蔗糖合成酶活性虽有提高，但这种效应要低于蔗糖对它的影响。模拟蔗糖水解的处理也没有达到蔗糖的促进效应。加入NAG阻断己糖调节途径，对蔗糖的调节效应没有大的影响。这说明蔗糖调节是不依赖己糖激酶的途径。TreatmentSolutionDWg.百粒-1Sucrosecontentmg.g-1DWTotalsugarcontentmg.g-1DWSuSyactivityµmol.mg-1pro.min-1WaterSucrose(20mM)Mannose(20mM)3-O-MG(20mM)0.6430±0.0020.6230±0.0090.7590±0.0030.7023±0.00117.4016±1.2122.9740±0.5613.7867±1.2215.2961±0.6522.8938±2.9541.4775±2.2825.0429±1.6729.7268±1.060.3283±0.020.5385±0.050.3317±0.020.4974±0.025.己糖类似物处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响Table3.SugarregulationofSuSyactivityinthericegrains.Excisedricepanicleswerefedwithwater,20mMsucrose,20mMglucose,20mMmannoseand20mM3-O-methylglucose(3-O-MG)inthedarkfor24h.由表3可知，糖的类似物甘露糖，3－氧甲基葡萄糖培养离体穗24小时，在百粒重、蔗糖含量、总糖含量及蔗糖合成酶活性与对照差异不大。6.蔗糖对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的可逆调节Sucrosecontent(mg.g-1DW)20406080100120TreatmentSolutionH2OSucH2O/SucSuc/H2OSolubletotalsugarcontent(mg.g-1DW)020406080100120TreatmentSolutionH2OSucH2O/SucSuc/H2OSucroseSynthaseActivity(mol.mg-1pro.min-1)0.0.2.4.6.8Fig.3.Sucrose-mediatedchangesinSuSyactivitywerereversible.Fourexcisedricepanicles,andtwoofthemwereplacedinwaterandtheothertwoin100mMsucrose.SuSyactivityweremeasuredfromonepaniclesofeachtreatmentafter24h.Atthesametime,theothertwopanicleswereplacedintheoppositetreatmentsolutionforanother24h.由图3可见，蔗糖处理过的离体穗再放于水中24小时后可以解除蔗糖效