离心实验方案

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资源描述

离心实验报告(方案)(分离并鉴定叶绿体和线粒体、细胞核)一、实验仪器剪刀、研钵、三角瓶、小烧杯、纱布、超声波细胞破碎仪、玻棒、离心管、注射器、离心管架、普通高速离心机、超速离心机、载玻片、盖玻片、胶头滴管、接种环、镊子、擦镜纸、吸水纸、冰箱、数码显微镜二、实验药品液氮、50mmol/LTirs-盐酸缓冲液(PH=7.4)、0.25mol/L蔗糖溶液、詹纳斯绿染液(线粒体)、姬姆萨染液(细胞核)、香柏油(人工)、二甲苯三、实验材料蒌蒿鲜茎叶、根四、实验原理将破碎后的细胞进行离心实验,设置不同转速梯度,从而得到不同转速下的沉淀,收集沉淀用数码显微镜进行观察,看是否分离得到线粒体和叶绿体。五、溶液配制1、缓冲液的配制:50mmol/LTirs-盐酸缓冲液配法(PH=7.4):50ml0.1mol/LTris溶液溶于42ml0.1mol/L的盐酸,混匀加水稀释至100ml0.1mol/LTris:12.114g溶于1L水,0.1mol/L盐酸:1ml36%HCL定容与100ml水中2、0.25mol/L蔗糖溶液(悬浮介质):8.56g溶于100ml水中注:蔗糖等一些小分子溶液,可以预先在分离的样品中形成密度梯度,在上面再加上一层少量的大分子溶液后,离心,大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分,就会出现许多层。然后0.25mol/L的蔗糖形成的密度梯度的最大值比叶绿体匀浆介质密度要小,满足密度梯度离心的要求低温下研磨一般都是保护作用,防止蛋白质变性3、1%詹纳斯绿染液:称取50mg(pH7.4),詹纳斯绿B溶于5ml生理盐水中,稍微加热使之溶解后,过滤,即为1%原液4姬姆萨染液(Giemsa):称取姬姆萨粉0.5g,甘油33ml、纯甲醇33ml。先在姬姆萨粉中添加少量甘油,然后在研钵内研磨至无颗粒状,再将剩余甘油倒入混匀,56℃左右保温2h使其充分溶解,最后加甲醇混匀,成为姬姆萨原液,保存于棕色瓶。使用时吸出少量,用1/5mol/L磷酸缓冲液作10~20倍稀释。六、实验步骤:1、样品采集:采集菊科蒿属植物蒌蒿鲜样(茎、叶),用自来水和去离子水反复冲洗干净,淋干水分,剪成碎片至于研钵内加液氮研成精细粉末,称取5g(0.5g)粉末溶于200ml(20ml)缓冲液混匀测ph=7.15(量多需等比例扩大)2、细胞破碎:将混合液分装入100ml三角瓶中,用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎。机器参数设置如下:6号变幅杆(10-100ml),超声时间3s,间隙时间3s,总时20min,温度21℃,功率45%。5、超、高速离心实验:(1)、将破碎溶液进行过滤(用两层纱布),上层残渣即为细胞壁部分(收集入冰箱保存待测),滤液为原生质体部分(包括各种细胞器和细胞液等),待离心。(2)将滤液分装入离心管,先用高速离心机进行初步离心实验,依据现有资料设置离心力和转速,参数如下:离心力(转数)所得沉淀600g(2400转)细胞核部分2000g(4000转)叶绿体部分10000g(9800转)20000g(13900转)线粒体部分(分级得到的线粒体可采用蔗糖密度梯度离心方法来纯化)(3)根据浓度梯度、根茎叶、嫩中老三个指标来进行实验(浓度单位:mg/L,mg/kg)离心前不同浓度、不同部位、不同时期镉的含量镉处理浓度离心前镉含量0510204080160嫩根嫩茎嫩叶中根中茎中叶老根老茎老叶离心后不同浓度、不同部位、不同时期镉的含量镉处理浓度离心后镉含量0510204080160嫩根嫩茎嫩叶中根中茎中叶老根老茎老叶细分的话:1、不同浓度、嫩苗期、根茎叶部位、不同转速下镉的含量不同浓度,600g嫩根离心镉含量(细胞核部分)600g嫩根510204080160不同浓度,10000g嫩根离心镉含量(线粒体部分)10000g嫩根510204080160不同浓度,600g嫩茎离心镉含量(细胞核部分)600g嫩茎510204080160不同浓度,2000g嫩茎离心镉含量(叶绿体部分)2000g嫩茎510204080160不同浓度,10000g嫩茎离心镉含量(线粒体部分)10000g嫩茎510204080160不同浓度,600g嫩叶离心镉含量(细胞核部分)600g嫩茎510204080160不同浓度,2000g嫩叶离心镉含量(叶绿体部分)2000g嫩茎510204080160不同浓度,10000g嫩叶离心镉含量(线粒体部分)10000g嫩茎5102040801602、不同浓度、中苗期、根茎叶部位、不同转速下镉的含量不同浓度,600g中根离心镉含量(细胞核部分)600g嫩根510204080160不同浓度,10000g中根离心镉含量(线粒体部分)10000g嫩根510204080160不同浓度,600g中茎离心镉含量(细胞核部分)600g嫩茎510204080160不同浓度,2000g中茎离心镉含量(叶绿体部分)2000g嫩茎510204080160不同浓度,10000g中茎离心镉含量(线粒体部分)10000g嫩茎510204080160不同浓度,600g中叶离心镉含量(细胞核部分)600g嫩茎510204080160不同浓度,2000g中叶离心镉含量(叶绿体部分)2000g嫩茎510204080160不同浓度,10000g中叶离心镉含量(线粒体部分)10000g嫩茎5102040801602、不同浓度、老苗期、根茎叶部位、不同转速下镉的含量不同浓度,600g老根离心镉含量(细胞核部分)600g嫩根510204080160不同浓度,10000g老根离心镉含量(线粒体部分)10000g嫩根510204080160不同浓度,600g老茎离心镉含量(细胞核部分)600g嫩茎510204080160不同浓度,2000g老茎离心镉含量(叶绿体部分)2000g嫩茎510204080160不同浓度,10000g老茎离心镉含量(线粒体部分)10000g嫩茎510204080160不同浓度,600g老叶离心镉含量(细胞核部分)600g嫩茎510204080160不同浓度,2000g老叶离心镉含量(叶绿体部分)2000g嫩茎510204080160不同浓度,10000g老叶离心镉含量(线粒体部分)10000g嫩茎510204080160最后总结变化趋势,绘制趋势图七、活性鉴定(细胞器鉴定):将分离出来的沉淀用来镜检1、叶绿体:在洁净的载玻片上滴一滴清水,用镊子或者接种环取一块沉淀,盖上盖玻片,制成临时装片,用吸水纸吸取周边多余水分,用显微镜低倍镜观察,找到叶片细胞后,再换高倍镜观察、拍照。在高等植物中叶绿体像双凸或平凸透镜,长径5~10um,短径2~4um,厚2~3um。图片中看到的叶绿体大概为1.5cm即15mm换算:1m=10-2cm=10-3mm=10-6um=10-9nm10um(长径)*1600(放大倍数100*16)=10*10-6*1.6*103=16mm(与照片显示结果相同,可见,所看到绿色物体确定为叶绿体)2、线粒体:在洁净的载玻片上滴一滴詹纳斯绿染液,用镊子或者接种环取一块沉淀,盖上盖玻片,制成临时装片,用吸水纸吸取周边多余水分,用显微镜低倍镜观察,找到叶片细胞后,再换高倍镜观察、拍照。线粒体的形状多种多样,一般呈线状,也有粒状或短线状。线粒体的直径一般在0.5~1.0μm,在长度上变化很大,一般为1.5~3μm,长的可达10μm数量级大概是叶绿体的十分之一,因而上图中所看到的透明细胞器可能不是线粒体,3、细胞核:取核沉淀1滴涂于载玻片,加入Carnoy固定液15min,晾干。Giemsa染液染10min,蒸馏水漂洗数秒,用滤纸吸干水、用显微镜(40*)检查,细胞核呈紫红色,混杂的胞质为浅蓝色碎片。

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