海洋生物毒素的提取.

海洋生物毒素的提取、分离和鉴定---------------------以麻痹性贝毒、河豚毒素为例一、麻痹性贝毒1、来源有害赤潮特别是有毒赤潮对人类生命健康和海洋生态系统的威胁日益严重，已引起人们的广泛关注。有毒赤潮藻类可产生多种毒素，这些毒素可通过食物链在贝类或鱼类等生物体内累积放大，当人们误食这些染毒的海产品时，就会发生中毒死亡，因此，这些毒素又常被称为贝毒素或鱼毒素。2、作用机理•麻痹性贝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)是一类阻断神经细胞钠离子通道，对人体神经系统产生麻痹作用的海洋生物毒素。该毒素对人体毒性极强，且无特效解救药物，对人类健康影响很大。我国近海多种可食用贝类中均含有麻痹性贝毒，福建省东山县广东省大亚湾及台湾省近年都发生因食用染毒贝类而引起多人中毒死亡事件!3、物理化学性质a、通常情况下，PSP毒素化学性质比较稳定，但在碱性水溶液中容易发生分解;b、在强酸性水溶液中，部分毒素容易发生转化，例如N一磺酞氨甲酞基类毒素在加热、强酸性条件下会脱掉磺酞基，生成相应的胺基甲酸醋类毒素。c、在pH为2-4，尤其pH=3时毒素最为稳定，在一18℃以下能够较长时间保存;d、麻痹性贝毒本身紫外吸收很弱，且不能产生荧光，但其在碱性条件下氧化再酸化能生成荧光物质，这种性质成为PSP荧光检测的主要依据。4、提取、分离和检测技术①样品采集扇贝采集，样品采集后现场用水冲净外壳，并用不锈钢刀打开，将贝肉、性腺和消化腺分离，用纱布吸除多余水分，然后冰块保存运至实验室，-20度贮存。②提取•贝类PSP的提取方法主要采用AOAC法，该方法简单描述为:•a、在称重的烧杯中称取100g均质的样品，加0.lmol/LHCl溶液100mL充分搅拌，检查pH(pH应为2.0-4.0，以3最佳)。需要时，可逐滴加入5mol/LHCl溶液或0.lmol/LNaOH溶液调整pH，加碱时速度要慢，同时需不断搅拌，防止局部碱化破坏毒素。•b、将混合物加热，并徐徐煮沸5min，冷却至室温，调节pH至2.0-4.0(勿4.5)。③分离•将混合物移至量筒中并稀释至200mL。将混合物倒回烧杯，搅拌至均质状，使其沉降至上清液呈半透明状。利用超速离心机，将混合物或上清液以3000r/min离心5min。或者用滤纸过滤。④鉴定方法a、小白鼠生物检测法PSP的小鼠生物法检测程序已由美国分析化学家协会(AOAC)标准化(AOAC,1990)，并在世界范围内被广泛接受。虽然小鼠生物法操作简单、能反应样品总的毒性，但也有很多不足的地方，如只能检测毒性大小，而无法确定毒素的种类和含量;小鼠的不同品系、批次、大小对毒素的测定的灵敏度有很大的影响;实验结果可重复性、可比性差。b、高效液相色谱法(HPLC)分析高效液相色谱法(HPLC)又称高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱、近代柱色谱等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。c、细胞毒性检测法根据离子通道类毒素可以专一性地作用于细胞膜离子通道的特点建立起来的细胞毒性检测技术，可以快速敏感的检测毒素。它是利用毒素对细胞的毒性作用来检测毒素存在与否以及毒性大小的一种技术，可以直接体现所测样品的毒性状况。麻痹性贝毒（PSP)可以作用于Na+通道的1位点，阻断Na+内流，当在培养的细胞中加入Na+通道活化剂，细胞会由于Na+内流过多而造成肿胀，甚至死亡，但如果同时加入具Na+通道阻断作用的毒素PSP,Na+内流会因拮抗作用而受到限制，使得细胞成活，由此可以确定毒素的存在，并根据细胞的成活率对毒素进行定量分析。针对PSP的仪器检测方法还有液相色谱一质谱联用，毛细管电泳法，流动注射法等，但都因灵敏度低或毒素组分分离度差等原因而未能得到广泛使用。二、河豚毒素1、河豚简介河豚鱼(Balloonfish)，属硬骨鱼纲、鱿形目。世界上有200多种，可引起中毒的有9种。河豚主要分布在渤海、东海、黄海及江河下游，为近海与河川底层肉食性海产有毒鱼类。河豚鱼肉质细嫩、鲜美，曾有“拼死吃河豚”之说，吃河豚中毒死亡者，在国内外屡见不鲜，就是食用河豚经验比较丰富的日本人，据说每年中毒死亡者也有几百人之多。2、河豚毒素简介•70年代成功的从河豚鱼体内有毒部位(卵巢、精巢、肝脏、脾、胃、肠等)分离提纯河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)。TTX是一种结构为笼形原酸脂类的非蛋白神经毒素，其分子式为C11H17O8N3，分子量为319。•河豚毒素呈白色结晶状，无臭，易潮解，在镇痛、降压、抗心率失常、局麻、戒毒、抑瘤等方面发挥着不可替代的医疗作用，因此具有极高的经济价值和医疗价值。由于河豚毒素能特异性阻断钠离子通道，在生理研究上，已成为机制研究的工具药，为神经细胞膜研究必不可少的标准药物.3、提取、分离和检测技术•①材料：棕斑腹刺豚。•②TTX的提取•取河豚鱼的内脏捣碎后，分为四份，分别加入5倍量的甲醇、乙醇、乙酸、水，然后将装有四种不同溶剂的提取瓶置于60℃恒温水浴锅中8h，使TTX充分溶解于溶剂中。③分离•取出三角瓶，3500rpm离心10min，分别收集上清液和固体物，将固体物再重复以上步骤2次，合并上清液。若脂肪过多可用乙醚进行脱脂处理。将上述粗提液减压蒸馏。得到的少量液体按照溶剂的不同编号为1号(乙酸提取),2号(甲醇提取),3号(乙醇提取),4号(水提取)处于冰箱中备用。④TTX的鉴定与检测•a、小白鼠生物检测法•选择体重为25士2g左右的小白鼠，随机分为两组，分别腹腔注射0.8m1,1.0ml上述提取液，观察小鼠症状。小白鼠生物检测法结果与讨论•结果•小白鼠经腹腔注射四种溶剂提取的河豚内脏提取液后，均呈现中毒症状，观察症状如下:注射0.8ml样品液的小鼠最初表现平静，过30min左右开始浑身打颤，最后身体上的毛都湿了。但经过5-6h后，又恢复平静。随着时间的延长，小鼠也恢复正常，大约一天的时间，小鼠完全恢复正常。而注射1ml样品液的小鼠最初也是表现为平静，继而出现不安，突然旋转，大呼吸，最后突然跳起，翻身，四肢痉挛，腹部朝上死亡。该死亡症状与文献报道的河豚毒素中毒死亡症状一致。小白鼠的死亡时间却不一致，2,3,4号提取液致死时间几乎相同，且时间较长为6-8h，而1号提取液对小白鼠的致死时间相对较短为4一5h。讨论•本实验中采用的两组小鼠实验因为注射的样品量不同，直接导致了小鼠的不同行为症状，注射0.8ml样品液的小鼠大量出汗、打颤、但没有死亡，2天后恢复正常。通过对注射lmL样品液的小白鼠中毒实验死亡症状的观察，验证了甲醇、乙醇、乙酸、水这四种溶剂均能提取出河豚毒素，但死亡时间不一致可证明其提取的毒量的差异，因均取材于同一河豚鱼故可抵消毒素的不同和毒力强弱这些因素带来的影响，所以小白鼠从注射到死亡的时间越长，说明其含毒量越低。即2,3,4号的含毒量较1号乙酸提取的河豚毒素含量低。从此实验可初步得出河豚毒素经乙酸提取的效果要好于甲醇、乙醇、水三种溶剂。b、薄层层析法•硅胶板的制作：称取硅胶H50g于研钵中，加入25ml0.5%的CMC，在研钵中研磨混匀至糊状无颗粒将其倒在层析板上，平铺均匀，(这样可铺三块长17cm、宽12cm的层析板)于110℃活化半小时后取出备用。•点样:20川样品液点于活化好的硅胶板上，点样点距离板底1.5cm，点样斑点直径控制在2~左右，样品间距约1.5cmo•展层:首先将展开剂置于层析缸中5min预平衡，再将点好样的层析板放人层析缸中室温展开(展开剂为正丁醇:醋酸:水=2:1:1)，待展开剂前沿走至距板顶1.0cm时取出，自然晾干。•显色:用喉头喷雾器将3mol/1KOH溶液均匀喷至层析板上，吹风机吹干，于160℃下烘15一20min，取出10min后立即扫描。瑞士卡玛TLCscamner-3全自动薄层层析仪薄层层析结果与讨论•结果:•肉眼观察1,2,3,4号提取液经薄层层析后在层析板上分别呈现四个黄褐色斑点，这些斑点直径不等，但展距(Rr值)相近，差别可能是溶剂的极性不同引起的。经复日成像系统扫描后这四个斑点清晰可见:1号所得的主斑点的直径相对较大。讨论上述提取的1,2,3,4号提取液经薄层层析后在层析板上均可见四个黄褐色斑点，这与文献报道的河豚鱼体内含有河豚毒素、河豚酸、卵巢毒素和肝脏毒素相吻合，且各自的Rf值相近，其中一个斑点特别明显，推测可能为河豚毒素。从扫描结果分析对比平行斑点的直径之间存在显著差异:1号提取展开的四个斑点直径均比2,3,4号的斑点直径大，尤其是河豚毒素的斑点直径更为明显。也就是说，1号乙酸提取的河豚毒素含量高于其他三种，这与小白鼠中毒实验得出的结论一致。•参考文献：杨春,苏秀榕,李太武等.低毒河豚鱼毒素的提取和检测[J].天然产物研究与开发,2003-10-30岳亚军;张律;游杰等免疫亲和柱净化-高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉和肝脏中河鲀毒素[J]，中国食品卫生杂志，2016-03-30扇贝中麻痹性毒素的提取与分离纯化林华娟“，秦小明‘，章超桦‘李政菊;胡蓉;吴霓;海南岛近岸海域贝类中的麻痹性贝类毒素[J]，海洋环境科学,2016-04-20江涛,双壳贝类中麻痹性贝类毒素的提取、分离和检测技术研究[J],暨南大学,2006-05-01姚建华,贝类毒素液相色谱—串联质谱检测技术的建立与应用[J],上海海洋大学,2010-06-06刘栋,高效液相色谱—串联质谱法检测多种贝类毒素研究[J],辽宁大学,2013-05-01感谢您的聆听！！！