科研计划书-媛媛1

张媛媛122011000038科研计划书项目名称:15d-PGJ2抑制单核/巨噬细胞株的生物活性及作用机制的探讨研究类型：联合攻关（）重点支持（√）自主创新与普及推广（）项目范围：指南项目（）招标项目（）常规项目（√）青年项目（）申请者：张媛媛申请单位：基础医学院单位归属：首都医科大学通讯地址：北京市丰台区右安门外西头条10号首都医科大学邮政编码：100069单位电话：[phone]电子邮箱：[e-mail]一、基本信息：项目信息中文题目15d-PGJ2抑制单核/巨噬细胞株的生物活性及作用机制的探讨英文题目学科1细胞生物学学科2分子生物学申请经费XX万元起止年月2012．1—2014．12申请者信息姓名张媛媛性别女出生年月民族汉学位硕士在读职称职务身份证号主要研究领域肝纤维化研究电话手机号码电子邮箱合作单位信息单位名称代码首都医科大学基础医学院项目摘要（限400字）：肝纤维化是多种病因所致的慢性肝病共有的病理过程，其主要病理特征是以胶原为主的细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）在肝脏内的过量沉积。肝脏肌成纤维细胞（hepaticmyofibroblasts,hMF）是合成和分泌ECM的主要细胞，在肝纤维化发生过程中起着决定性的作用。最近，骨髓来源的肌成纤维细胞颇受关注，然而对于它们在体内的迁移机制却知之甚少。鞘磷脂的代谢中间产物——磷酸鞘胺醇（sphingosine1-phosphate,S1P）作为细胞迁移的重要调节器，发挥着重要的生物学功能。本研究结合体内和体外实验，旨在证实在肝纤维化发生过程中骨髓间充质干细胞可向肝脏迁移分化为hMF，并以S1P为靶分子，探讨其介导骨髓间充质干细胞向受损肝脏归巢的作用。ICR小鼠经射线照射后通过尾静脉移植带有绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）的全骨髓细胞或骨髓间充质干细胞，4周完成骨髓重建后分别以CCl4和BDL制成肝纤维化模型。在1天、3天、2周、4周和6周时处死小鼠，取肝组织应用免疫荧光染色的方法鉴定并统计骨髓来源的hMF。同时，用高效液相色谱的方法测定纤维化肝组织和血清中S1P的含量，用Westernblot和real-timeRT-PCR的方法分别检测与S1P代谢相关酶的蛋白和mRNA水平，以及肝组织中S1P特异受体的表达变化。体外实验：应用BoydenChamber培养方法检测S1P对骨髓间充质干细胞迁移的作用。同时，采用S1P受体拮抗剂预处理细胞，鉴定参与S1P介导骨髓间充质干细胞迁移的受体类型。1．骨髓间充质干细胞在肝纤维化模型小鼠体内可迁移至肝脏，并在受损的肝组织内分化为hMF；2．纤维化肝组织和血清中S1P的含量显著增加，而骨髓中S1P的含量无明显变化。此外，纤维化肝组织中与S1P代谢相关的鞘胺醇激酶1（sphingosinekinase1,SphK1）mRNA表达上调，其活性也增强，S1P磷酸水解酶（S1Pphosphatase）以及裂解酶（S1PlyasemRNA）没有明显变化；3．S1P在体外明显刺激了骨髓间充质干细胞的迁移，呈剂量依赖性，受体S1P3参与了这一过程；4．体内实验中，受体S1P3的拮抗剂——Suramin明显抑制了骨髓细胞向受损肝脏的归巢；5．转化生长因子（TGF-）在体外能诱导骨髓间充质干细胞向hMF分化。结论：S1P/S1P3信号介导了骨髓间充质干细胞向受损肝脏的归巢，参与了肝纤维化的发生过程，提示S1P可以作为肝纤维化的一个生物标记物，以S1P/S1P3信号为作用靶点将有望设计出新的抗纤维化药物。关键词（用分号分开，不超过5个）肝纤维化；骨髓间充质干细胞；磷酸鞘胺醇；骨髓移植；细胞迁移；细胞分化；绿色荧光蛋白二、项目组成员姓名性别年龄学位研究方向单位XX男25硕士在读肝纤维化研究首都医科大学XXX女23硕士在读肝纤维化研究首都医科大学三、立题依据(一)研究现状肝纤维化是多种病因所致的慢性肝病共有的病理过程，涉及到细胞、细胞因子和细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）之间一系列复杂的变化，其主要特征是以胶原为主的细胞外基质在肝脏内的过量沉积。进一步发展可引起肝小叶结构改建、假小叶及结节形成，即肝硬化。慢性肝病的病因包括病毒性肝炎、慢性酒精中毒、慢性胆汁瘀积、化学毒物或药物、肝脏淤血、遗传和代谢疾病以及血吸虫的感染等，所有这些病因均可导致肝细胞炎症及损伤，使肝细胞呈弥漫变性、坏死，继而坏死区胶原纤维增生。大量研究证实，肝脏肌成纤维细胞（hepaticmyofibroblasts,hMF）是合成和分泌细胞外基质的主要细胞，在肝纤维化发生过程中起着决定性的作用。它们在肝细胞坏死部位增殖，分泌炎症细胞因子和趋化因子，合成大量基质蛋白（如：I型胶原，III型胶原等）和基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）等，因而导致肝纤维化[1-3]。近年来，关于肌成纤维细胞的来源问题成为国内外研究的热点。原因在于，探明了肌成纤维细胞的来源，对其分化进行可控性调节，就有可能从源头上解决肝纤维化这一难题，从而为这一难治性疾病的防治提供新的线索。多数学者认为肝脏肌成纤维细胞是由肝星状细胞活化而成[4]。在正常肝组织中，肝星状细胞约占肝脏细胞总数的5~10%，位于窦周Disse间隙。急性或慢性肝损伤时，肝星状细胞被激活，转化成肌成纤维细胞，表达平滑肌肌动蛋白a（smoothmusclea-actin,a-SMA）。也有学者认为肝脏肌成纤维细胞来源于汇管区和中心静脉区的成纤维细胞，其研究发现在实验性导管源性肝硬变的发生过程中，这些成纤维细胞转化成表达a-SMA的肌成纤维细胞，是肝硬变发生过程中的决定因素[5]。然而，肝星状细胞和成纤维细胞均为肝组织固有细胞，由于其细胞表面没有特殊的识别标志，因此很难在体内以这样的细胞为靶点设计出有效的抗肝纤维化方案。最近大量研究表明，肝脏肌成纤维细胞有可能存在第三种来源——骨髓（bonemarrow,BM），并认为它们主要来源于骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）[6-10]。由此说明，当肝脏受损伤以后，骨髓干细胞可以迁移到受损的肝脏并分化为肌成纤维细胞从而参与肝纤维化。然而，骨髓细胞是如何迁移到受损的肝组织并参与肝纤维化的发生？哪些生物活性分子在这一过程起主要作用？这些问题尚需进一步研究。很显然，阐明了这一机制将有助于我们制定新的特异的抗纤维化治疗方案。研究发现，膜磷脂的代谢产物在细胞正常的生命活动中起着举足轻重的作用，如三磷酸肌醇（IP3）、二脂酰甘油（DAG）等就是重要的第二信使。磷酸鞘胺醇（sphingosine1-phosphate,S1P）是新近发现具有重要生理功能的另一种膜磷脂代谢产物，它在细胞增殖、存活、迁移、分化以及免疫功能的调节等方面都有着极其重要的作用[11-15]。S1P是鞘磷脂的一个中间代谢产物，体内调节S1P合成的主要相关酶有：催化鞘胺醇磷酸化生成S1P的鞘胺醇激酶（sphingosinekinase1and2,SphK1,SphK2）；促进S1P降解的S1P磷酸酶（S1Pphosphatase）和裂解酶（S1Plyase）[15]。研究证实，S1P既可以作为细胞内第二信使发挥作用，又可以与细胞表面的特定受体结合而发挥重要的生物学功能[11]。由于S1P作为胞内第二信使的作用靶点目前还不清楚，因此相关报道较少；而S1P作为胞外配体的研究较多，它可与其相应受体结合后激活或抑制多种信号通路从而发挥不同的生物学效应。S1P受体家族最早被命名为内皮细胞分化基因（endothelialdifferentiationgene,EDG）受体，属于G蛋白偶联受体家族。现已发现这类Edg受体家族有5个成员：EDG1、EDG5、EDG3、EDG6和EDG8（现已分别改称为S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5）[16]。目前对于S1P研究比较多的一个方面是促进细胞迁移的作用[17]，而且有研究表明S1P在体外明显刺激了骨髓干细胞的迁移[18]。由此，我们提出了如下假说：当肝脏受损伤后，肝组织中S1P含量上升，从而介导骨髓细胞向受损肝脏归巢并分化为肌成纤维细胞参与纤维化。本研究拟结合体外和体内实验，应用两种经典肝纤维化模型——四氯化碳（CCl4）模型和胆管结扎（BDL）模型，首先证实肝脏受损以后骨髓细胞是否参与了肝纤维化的发生，继而以S1P为靶分子，探讨其是否参与了肝纤维化，以及它在骨髓细胞向受损肝脏迁移并分化为肌成纤维细胞过程中的作用机制，从一较新的视角探讨骨髓细胞在肝纤维化发生过程中的作用。对这一过程的深入研究将有助于我们更深入地了解肝纤维化的发生机制，从而设计出新的抗纤维化治疗方案。图2磁酶免化学发光分析原理图（摘自参考文献26）用磁微粒化学发光法检测癌胚抗原的优点如下：1.与单克隆抗体结合反应特异性高，重复性好；2.碱性磷酸酶显色结果稳定，不含致癌物；3.酶标记单克隆抗体特异性强，无放射污染和危害；4.磁性抗体分离技术，不用离心，不用液相；5.反应灵敏、准确、检测速度快，与临床符合率较高，为临床提供了较为可靠的诊断依据[18]。本论文将化学发光磁酶免疫法用于肿瘤标志物的检测中。肿瘤标志物（Tμmormarker，TM）作为诊断肿瘤的重要指标，体内TM含量的变化可以为临床医生提供很多信息，从而指导他们及早地发现肿瘤，更合理的为患者提供治疗措施[19]。但体液中肿瘤标志物的含量通常非常的低，一般的检测方法很难对其进行准确的检测。本论文通过制备磁微粒化学发光酶免疫分析试剂盒对血清中的癌胚抗原CEA进行检测，实验中制备了试剂盒的各组分，对抗体与磁微粒的配比，反应温度、反应时间进行了优化。对比了国产和进口磁微粒分别与抗体连接的效果，最后用优化后的试剂盒来检测临床血清并对该试剂盒的热稳定性进行了评价。临床CEA血清检测结果不但能满足临床分析检测的需求，而且可以节省成本。实验技术路线（见图3），磁微粒化学发光法是一种很有前景的分析检测方法，此方法在肿瘤标志物检测中的应用与推广必将使肿瘤早期诊断成为可能，从而推动人类尽早攻克肿瘤[20]。(二)拟解决的问题：⑴检测磁微粒在胚癌基因和正常原胚组织中的表达并比较其不同⑵检测胚癌基因不同手术病理分期患者原胚组织中磁微粒的表达情况主要参考文献：[1]张丽明．化学发光标记及发光免疫分析[J]．基础医学与临床，1995，15（4）：234-247．[2]宇传华．诊断医学统计学[M]．北京:人民卫生出版社，2005：13-19．[3]BaeyensWR，SchulmanSG，CalokerinosACetal．Chemiluminesce-baseddetection：principlesandanalyticalapplicationsinflowingstreamsandinimmunoassays[J]．J．Pharm．Biomed．Anal，1998，17(6~7)：941~953．[4]林金明．化学发光基础理论与应用[M]．北京：化学工业出版社，2004:1-28．[5]王自正．现代医学标记免疫学[M]．北京：人民军医出版社，2000：7-26．[6]WangJ，DaX，HeYH，etal．Localizationoftumorbychemiluminescenceprobeduringphotosensitizationaction[J]，CancerLetters．2002，188：59-65．[7]张忠英，高惠川，林永志等．电化学发光免疫分析技术联合检测CYFRA21-l和癌胚抗原对肺癌的诊断意义[J]，福建医科大学学报，2001，35(2)：169-171．[8]XueMD，HaruyamaT，KobatakeE，etal．Electrochemicalluminescenceimmunosensorforfetoprotein[J]．SensActuatorsB，1996，36：