稳定性二氧化氯溶液杀灭霉菌孢子效果的研究

共5页第页1稳定性二氧化氯溶液杀灭霉菌孢子效果的研究邱汉章（漳州师范学院化学系环境科学01级363000）摘要：本文就稳定性ClO2溶液的不同浓度、作用时间和温度对霉菌孢子进行杀灭试验。结果表明稳定性二氧化氯溶液对霉菌孢子的作用效果是多种因素的综合结果。而且霉菌对稳定性二氧化氯溶液的药效反应存在明显种属间的差异。不同存放时间杀灭霉菌孢子的实验也表明在静置条件下现配现用效果最佳。关键词：二氧化氯稳定性霉菌THESTUDYONKILLINGMILDEWSPOREEFFICACYOFSTABLECHLORINEDIOXIDESOLUTIONQiuhanzhang(01environmentalscienceinChemistryDepartment,ZhangZhouNormalUniversity363000)Abstract:It’sagermicidalexperimentaboutstablechlorinedioxideunderdifferentconcentrations,differenttimeperiodsandtemperaturestowardsfungispore.Theresultindicatesthattheefficacyforstablechlorinedioxidekillingfungisporeisacompoundofmanyfactors.Differentspeciesofmildewactdiversely.Theresultofdifferenttimeperiodonkillingeffectshowsthatnewlymake-upsolutioninstillnessstatehasthebestefficacy.Keywords:chlorinedioxide;stabilization;fungi作为氯制剂的ClO2，不仅杀菌效果快速、可靠，而且毒性低[1-2]，运用范围广，对环境不产生影响的一种新型高效消毒剂，世界卫生组织（WHO）将其列为IA级高级安全消毒剂，工业发达国家将其称为“第四代消毒剂”。美国、日本、加拿大等发达国家早已将其作为氯制品消毒剂的一种最有前途和最理想的替代品而广泛应用，对稳定性ClO2科研开发和应用领域的研究也不断取得新进展[3]。在我国已广泛应用于医疗卫生、食品工业、果蔬保鲜、环境污染处理等方面。霉菌（mold）广布于外界环境中，它们在食品或许多制品上可以作为正常菌相的一部分，作为空气传播性污染物，常造成各类的食品、粮食及许多工农业制品由于遭受其侵染而霉坏变质；有些霉菌的有害代谢产物引起各种急性和慢性中毒，特别是有些霉菌毒素具有强烈的致癌性，实践证明，一次大量食入或长期少量食入，能诱发癌症[4]，特别随着霉菌毒素污染与肝癌发生特异性关系的确定，霉菌生态对人类的影响越来越受到关注[5]。因此，加强对霉菌污染的预防和消毒，对人类健康具有重要的意义。对于稳定性ClO2应用于产毒霉菌的消毒，罕见报道。本课题是在实验室条件下，对稳定性ClO2溶液杀死几种常见产毒霉菌孢子的浓度、作用时间、作用温度进行比较，结果报道如下。1材料与方法1.1试验菌株培养与菌悬液的制备1.1.1试验菌株黑曲霉(Asp.niger)烟曲霉（Asp.fumigatus）黄绿青霉（Penicilliumcitreoviride）1.1.2培养基配制与培养条件共5页第页2本试验所用培养基均采用孟加拉红培养基，培养温度26±2℃。1.1.3菌悬液的制备在无菌条件下操作，取生长丰满的霉菌培养皿1个，用接种环挑取霉菌孢子数环接入盛有10ml无菌水的试管中，振荡后。用无菌的单道移液器吹吸使孢子充分散开。将孢子过滤液用血细胞计数板测定孢子浓度，再用无菌水调整孢子液至0.5-1.5*106个孢子/毫升。1.2稳定性二氧化氯溶液和中和剂的配制1.2.1稳定性二氧化氯溶液的配制取10mol2%的二氧化氯溶液于一小烧杯中，称取0.5g柠檬酸加入小烧杯中活化3min。然后取不同体积活化后的二氯化氯溶液加入装有相应体积的无菌水的烧杯中，制成各种不同浓度梯度的二氧化氯溶液。1.2.2中和剂的配制磷酸缓冲液：取Na2HPO4.12H2O7.164g，用水定容至100ml为A液.NaH2PO4.2H2O3.121g，用水定容至100ml为B液。取A液92ml,B液8ml,混合即成，0.2molPH=5的缓冲液，临用时稀释10倍，即成0.02MPH=5的磷酸缓冲液。称取0.155g硫代硫酸钠晶体溶于100ml0.02mol/lPH=5的磷酸缓冲液中，制成0.1%的Na2S2O3磷酸缓冲溶液作为试验所需的中和剂。1.3稳定性ClO2中和剂试验1.3.1中和剂选择的原则实验设平行7组（见下表1），每组3次重复；试验结果，以第6、7组不长菌，第3、4、5三组间菌数误差率不超过10%；第1组不长菌或菌数远小于第2组，第2组菌数大于100cfu/ml，则所用的中和剂及其浓度适宜。1.3.2操作步骤取4.5ml消毒液于试管内，置20±2℃水浴中5min后，加菌悬液0.5ml，作用1min；取0.5ml菌药混合液，加入4.5ml中和剂的试管内，混匀。中和作用5min，取该液或其稀释液1.0ml接种平皿。倾注孟加拉红培养基并混匀。于28℃培养4-5d，观察结果。用丙二酸—碘量法进行滴定，测定二氧化氯溶液与中和剂中和体积比。1.4不同药剂浓度和作用时间的杀灭霉菌孢子试验取4.5ml不同浓度的消毒液于试管内，置20±2℃水浴中5min后，加菌悬液0.5ml，作用不同的设计时间后；迅速取0.5ml菌药混合液，加入4.5ml中和剂的试管内，混匀。中和作用5min，取该液或其稀释液1.0ml接种平皿。倾注孟加拉红培养基并混匀。于28℃培养4-5d，观察最终结果。1.5温度对霉菌孢子杀灭效果试验取4.5ml不同浓度的消毒液于试管内，置不同的设计温度水浴中5min后，加菌悬液0.5ml，作用不同的设计时间后；取0.5ml菌药混合液，加入4.5ml中和剂的试管内，混匀。中和作用5min，取该液或其稀释液1.0ml接种平皿。倾注孟加拉红培养基并混匀。于28℃培养4-5d，观察最终结果。1.6药剂存放时间对霉菌孢子杀灭效果试验将配制好的80倍的二氧化氯溶液在室内常温条件下，每隔120min做一次对霉菌孢子杀灭效果试验。方法同上。1.7试剂与仪器孟加拉红培养基(BP，北京陆桥技术有限责任公司)、2%的二氧化氯溶液（广东微生物研究所）、，NaH2PO4.2H2O（上海新化化工厂，分析纯）、Na2HPO4.12H2O（广东汕头市西陇化工厂，分析纯）、Na2S2O35H2O(广东汕头市西陇化工厂，分析纯)共5页第页3SW-CJ-2FD超净工作台（苏州净化设备有限公司）、PYX-280S-A生化培养箱（广东科力）、BS110S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）、可调式移液管（上海雷勃分析仪器有限公司）、机械秒表（上海秒表厂）、M-50砂心过滤器（上海玻璃厂）2结果与分析2.1中和剂试验的试验结果表1：稳定性二氧化氯中和剂试验结果Table1:Resultsofneutralizertestforstablechlorinedioxide组别Grop平均菌数(cfu/ml)Averagecolonycount(cfu/ml)烟曲霉（Asp.fumigatus）黄绿青霉（Penicilliumcitreoviride）消毒剂+菌悬液Disinfectant+bacterialsuspension00(消毒剂+菌悬液)+中和剂(Disinfectant+bacterialsuspension)+neutralizer460100中和剂+菌悬液Neutrelizer+bacterialsuspension61703300(消毒剂+中和剂)+菌悬液(Disinfectant+neutrelizer)+bacterialsuspension62003370正常对照组Normalbacterialcontrol66003500未加菌中和剂对照NeturalizercontrolwithoutBacteria00未接种菌的培养基对照UninoculatedcultureMediumcontrol00从表1试验结果可见，第6、7组不长菌，第3、4、5三组间菌数误差率不超过10%；第1组不长菌或菌数远小于第2组，第2组菌数大于100cfu/ml，说明所用的0.1%Na2S2O3磷酸缓冲溶液及其反应所产生的产物,一、不影响霉菌孢子的萌发生长；二、可迅速与二氧化氯反应，因此0.1%Na2S2O3的0.02mol/lPH=5磷酸缓冲溶液可作为本实验适宜的中和剂。2.2ClO2消毒液对真菌的杀灭效果2.2.1不同浓度和作用时间的杀灭霉菌孢子试验从表2可看出：稳定性二氧化氯溶液对霉菌的作用浓度和作用时间对杀灭效果的影响十分显著。但两因素的不同组合对于三种霉菌杀菌效果有明显的差别，如同样的250ppm/L和10S的组合对黄绿青霉、桔青霉、黑曲霉杀菌率分别是98.70%、85.25%和76.36%，差异显著。这说明霉菌对稳定性二氧化氯溶液的药效反应存在明显种属间的差异。这在实际运用中具有重要意义，对造成霉菌污染应根据其种类的不同而选择不同作用浓度和作用时间组合，才有可能达到有效杀菌效果。共5页第页4同一种浓度稳定性二氧化氯溶液对霉菌孢子作用不同的时间，杀菌率也差异显著，在我们调查的PET瓶的CIP系统中，其PET瓶与稳定性二氧化氯溶液接触的时间一般为10s左右，而使用的作用浓度为一般均250ppm/L，从本试验的结果可见在此条件下，稳定性二氧化氯溶液对于黑曲霉(Asp.niger)和烟曲霉（Asp.fumigatus）其消毒效果并非理想。这也是在实际生产中经常出现霉菌污染的次品，造成的主要原因是由于消毒不彻底。表2：不同浓度和作用时间的杀灭霉菌孢子试验Table2：Efficacyofchlorinedioxidesolutioninkillingfungifordifferentperiodsoftime2.2.2不同作用温度的杀灭霉菌孢子效果试验从表3可见：在不同温度下,同一浓度的二氧化氯溶液杀灭霉菌孢子随温度的升高效果增强,这结果有利于在实际使用中,根据季节的不同合理调节浓度或通过提高温度来增强二氧化氯溶液杀灭霉菌孢子的效果。表3:不同作用温度的杀灭霉菌孢子效果试验Table3:Efficacyofchlorinedioxidesolutioninkillingfungifordifferenttemereture作用温度（℃）平均杀灭率（%）Avergekillingrate（%）黑曲霉(Asp.niger)黄绿青霉（Penicilliumcitreoviride）15202530354077.3485.6293.1098.1699.77100.0065.6770.2691.03100.00100.00100.00ClO2含量chlorinedioxidecontent（mg/L）作用不同时间（min）的平均杀灭率（%）Avergekillingrate（%）afterexposurefordifferentperiodsoftime（s）5102030500250125500250125500250125黑曲霉85.9872.9360.8182.8876.3664.8997.3977.3468.1598.8685.1670.97桔青霉98.38%76.12%66.99%96.7588.3165.0699.61%85.25%75.56%黄绿青霉98.0598.7070.7899.92%98.74%83.57%10010097.4099.99%99.92%83.85%100100100共5页第页52.2.3不同存放时间杀灭霉菌孢子效果试验表4：不同存放时间杀灭霉菌孢子效果试验（25℃）Table4：Efficacyo