液相色谱-质谱-核磁共振联用技术及其在药物代谢与结构鉴定中的应用

液相色谱－质谱－核磁共振联用技术及其在药物代谢与结构鉴定中的应用学院：海洋港口学院班级：14制药工程学号：1423014113姓名：何倩时间：2015年1月6日【前言】液相色谱－质谱－核磁共振（ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ）联用技术早期发展十分缓慢，主要受制于ＮＭＲ仪的灵敏度、溶剂峰抑制问题和ＮＭＲ与ＭＳ联机系统等问题［1］。近年来，随着ＮＭＲ波谱仪磁场强度的提高、ＬＣ－ＮＭＲ专用探头的设计及溶剂峰抑制技术的发展，解决了动态变化、灵敏度及溶剂抑制（尤其是梯度系统）的问题，从而促进了ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ联用技术的迅速发展。ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ技术的快速发展在分析方面具有突出的优点，目前本技术以ＬＣ－ＭＳ为主要分析手段，它集液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度于一体，被广泛应用于实验研究中，如药物代谢研究［2］、药动学研究［3］、药物多组分含量测定［4］等。虽然ＭＳ可以提供化合物的分子离子峰和碎片离子峰进行分析，但是ＬＣ－ＭＳ却不能明确地鉴定一些未知的具有光学和几何异构体的化合物结构。而且，一些不易离子化的化合物ＭＳ响应很低，生物基质的抑制也影响化合物的离子化。因此，在某些研究中需要利用ＮＭＲ来研究化合物的结构信息。在这种情况下ＬＣ，ＭＳ，ＮＭＲ３种技术在线联合使用形成ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ在线系统，它是进行药物代谢、结构鉴定等方面研究的强有力工具，目前该技术已在多个领域应用广泛。【正文】一、ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ在药物代谢中的应用１９９５年，Ｐｕｌｅｎ等［5］使用ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ系统从混合物中分离并鉴定出一个有着２个相连三唑环结构的氟化物，其后Ｃｏｎｎｅｌｙ等［6］将２，３－苯并呋喃（ＢＦ）经大鼠腹腔给药后收集尿液，鉴别其代谢产物。ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ系统应用较成功的是对乙酰氨基酚的代谢研究：早期，Ｓｈｏｃｋｃｏｒ等［7］通过ＣＨ３ＣＮ／Ｄ２Ｏ双向体系反向梯度洗脱，经ＥＳＩ阳离子检测，对对乙酰氨基酚在人尿液中代谢物进行研究，不仅检测到传统产物外，还发现了其他内源性代谢物。其后，Ｂｕｒｔｏｎ等［8］采用ＷＥＴ溶剂峰抑制进行了相似实验，流动相：乙腈（溶剂Ａ）和Ｄ２Ｏ含０．１％（ｖ／ｖ）三氟醋酸－ｄ（溶剂Ｂ），梯度洗脱，开始１％Ａ到５０ｍｉｎ线性增加到３５％Ａ，流速０．５ｍＬ·ｍｉｎ－１，检测波长２１０ｎｍ［9］。Ｓｐｒａｕｌ等［10］采用冷冻探针仍对对乙酰氨基酚进行研究，灵敏度提高了３～４倍。另外Ｆｏｘａｌ等［１1］用ＨＰＬＣ－ＮＭＲ研究了异环磷酰胺的毒性和代谢物，观察尿液中各种指标的变化，并结合３１Ｐ－ＮＭＲ谱，鉴定出３个代谢物。而将固相萃取技术加入ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ系统后，Ｇｏｄｅｊｏｈａｎｎ［１2］利用ＬＣ－ＳＰＥ－ＮＭＲ－ＭＳ和低温探头技术研究了人尿中对乙酰氨基酚的代谢物，并鉴定了一种微量的新代谢产物ｅｔｈｅｒｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅｏｆ３－ｍｅｔｈｏｘｙ－ｐａｒａｃｅｔａｍｏｌ。当检测物浓度较低时加入ＳＰＥ是最有效的分析手段之一。二、ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ在结构鉴定中的应用１、在天然产物结构鉴定中的应用ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ所提供的大量ＵＶ、ＭＳ、ＮＭＲ信息，对分析结构复杂、混合成分多的天然产物具有重要作用。王映红等［１3］在对垂子买麻藤茎化学成分的研究过程中，应用ＬＣ－ＮＭＲ技术实现了该药材提取混合物的分离、鉴定。Ｗｏｌｆｅｎｄｅｒ等［１4］应用该技术结合活性分析实现了粗提取物中新型活性成分的靶向分离筛选，初步获得潜在活性的成分，大幅提高了筛选效率。２００５年Ｓｅｇｅｒ［15］报道应用ＬＣ－ＤＡＤ－ＭＳ／ＳＰＥ－ＮＭＲ联用技术鉴定ＤＣ中的脂苷异构体，将粉碎后的南非钩麻根茎以甲醇提取，粗提取物经硅胶柱色谱分离后用高速逆流色谱法（Ｈｓｃｃｃ）纯化，然后应用ＬＣ－ＵＶ－ＭＳ／ＳＰＥ－ＮＭＲ分析，以线性梯度洗脱成功鉴别出４种化合物［16］。刘影等［17］以ＮＭＲ／ＬＣ－ＭＳＰＤＳ谱学方法为核心手段，进行了连翘提取物ＬＱ－７中相关成分的同步结构分析研究。通过从混合物谱中挖掘相关性的ＬＣ－ＭＳ和１ＨＮＭＲ谱数据并实现可视化，简化了复杂混合物的分离分析过程。２、在有关物质结构鉴定中的应用同样ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ系统的高分辨能力还被应用于杂质检查、药物构型研究、生化药物和微生物代谢物等的研究。Ｍｉｓｔｒｙ等［18］用ＨＰＬＣ－ＮＭＲ与ＨＰＬＣ－ＭＳ结合确定了氟替卡松丙酸盐４个已知的二聚体杂质，杂质存在水平为０．０６％～０．９％；Ｂｅｈｎｋｅ等［19］采用Ｃ１８毛细管ＨＰＬＣ－ＮＭＲ研究了氨基酸类化合物。现今出现的ＬＣ－ＦＴ／ＩＲ（傅立叶红外）－ＴＯＦ／ＭＳ（飞行时间质谱）－ＮＭＲ多重联机系统［19］将ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ的分析能力进一步提高，其增加了检测器的种类，将流动相进行多次分流进入不同的检测器，产生大量分析数据，应用于样品中主成分或杂质检查，使分析更加快速准确。３、在药物构型研究中的应用Ｄａｃｈｔｌｅｒ等［20］用ＨＰＬＣ－ＭＳ和ＨＰＬＣ－ＮＭＲ在线联合技术进行菠菜和视网膜中的叶黄素和玉米黄质立体异构体的分离和测定，检测浓度可精确至毫微克浓度，并充分体现了ＮＭＲ的立体区分能力。Ｓｅｇｅｒ［21］应用ＬＣ－ＤＡＤ－ＭＳ／ＳＰＥ－ＮＭＲ联用技术鉴定南非钩麻（ＨａｒｐａｇｏｐｈｙｔｕｍｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓＤＣ．）中的脂苷异构体.Ｓｉｄｅｌｍａｎｎ等［21］应用该技术成功研究了葡糖苷酸与药物伊索克酸的４种缀合物的位置异构体。【总结】ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ联用的历史及在分析领域的应用历史还很短，但其具有如下优势［22］：（１）ＭＳ对化合物进行快速扫描，提供初步的结构信息；而ＮＭＲ进行详细的结构解析，形成了一种在线复合矩阵分析的模式［20］；（２）硫酸化、磷酸化、氮氧化等结合产生的代谢产物需要通过ＮＭＲ、ＭＳ等多重数据分析才能得出结构；（３）许多内源性、分析难度较大的代谢产物也可通过该系统进行检测。目前ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ的技术原理已经日趋成熟，主要问题已得到基本解决，应用领域已经非常广泛。另外，从色谱的角度来看，在线富集技术在毛细管分离上的应用，也会促进ＬＣ－ＭＳ－ＮＭＲ联用技术的发展。毛细管分离与ＮＭＲ和ＥＳＩ－ＭＳ及ＡＰＣＩ－ＭＳ结合的广泛应用可能会在药物代谢与结构鉴定方面取得突破，这种发展势必会大大加速新型药物的研究与开发。【参考文献】[1]李忠红，沈文斌.HPLC-NMR联用技术及其在药物研究中的应用[J].国外医学药学分册，2001，28(1)：47-50.[2]YazenMA，MelindaKS，ChuanC，etal.InfluenceofPheno-barbitalonMorphineMetabolismandDisposition：LC-MS/MSDeterminationofMorphine(M)andMorphine-3-Glucuronide(M3G)inWistar-KyotoRatSerum,Bile，andUrine[J].Cur-rentDrugMetabolism,2007，8(1):79-89.[3]ShiR，QiaoS，YuDQ,etal.SimultaneousdeterminationoffiveflavonoidsfromScutellariaBarbataextractinratplasmabyLCMS/MSanditsapplicationtopharmacokineticstudy[J].J.ChromatogrB,2011，879：1625-1632.[4]DuYF,LiuPW，YuanZF，etal.Simultaneousqualitativeandquantitativeanalysisof28componentsinIsodonrubescensbyHPLC-ESI-MS/MS[J].JSepSci,2010,33：545-557.[5]PullenFS,SwansonAG,NewmanMJ，etal.Oft-line’liquidchromatography/nuclearmagneticresonancemassspectrome-try-apowerfulspectroscopictoolfortheanalysisofmixturesofpharmaceuticalinterest[J].RapidCommunMassSpectrom,1995，9(11)：1003-1006.[6]ConnellyJC，ConnorSC，MonteS，etal.Applicationofdi-rectlycoupledHighperformanceliquidchromatography-NMR-Massspectrometryand1HNMRspectroscopicstudiestotheInvestigationof2，3-benzofuranmetabolisminSprague-dawleyrats[J].DrugMetabDispos,2002，30(12):1357-1363.[7]ShockcorJP，UngerSE,WilsonID，etal.CombinedHPLC，NMRspectroscopyandion-trapmassspectrometrywithappli-cationtothedetectionandcharacterizationofxenobioticandendogenousmetabolitesinhumanurine[J].AnalChem，1996，68(24)：4431-4435.[8]BurtonKI,EverettJR,NewmanMJ,etal.On-lineliquidchromatographycoupledwithhighfieldNMRandmassspec-trometry(LC-MS-NMR)：anewtechniquefordrugmetabolitestructureelucidation[J].JPharmViomedAnal，1997，15(12)：1903-1912.[9]杨德英.液相色谱与高磁场NMR和质谱仪联用：阐明药物代谢物结构的新技术[J].国外医学药学分册，1998，25(2)：126-127.[10]SpraulM，FreundAS，NastRE,etal.AdvancingNMRsen-sitivityforLC-MS-NMRusingacryoflowprobe：applicationtotheanalysisofacetaminophenmetabolitesinurine[J].AnalChem,2003，75(6)：1536-1541.[11]FoxallPJ,LenzEM,LindonJC，etaLNuclearmagneticreso-nanceandhigh-performanceliquidchromatograph广nuclearmagneticresonancestudiesonthetoxicityandmetabolismofif-osfamide[J].TherDrugMonit,1996，18(4)：498-505.[12]GodejohannM，TsengLH，BraumannU，etal.Characteriza-tionofaparacetamolmetaboliteusingon-lineLC-SPE-NMR-MSandacryogenicNMRprobe[J].JChromatogrA，2004，1058(1/2)：191-196.[13]王映红，贺文义，李小妹，等.高效液相-核磁共振仪联用技术在买麻藤属植物提取混合物中的应用研究[门.波谱学杂志，2002,3:301-302.[14]WolfenderJL,RodriguezS9Hostettmann.Liquidchromatog-raphycoupledtomassspectrometryandnuclearmagneticreso-nancespectroscopyforthescreeningofplantconstituent