端粒端粒酶的研究进展

端粒、端粒酶的研究进展早在30年代，两名遗传学家Muller和Mcclintock分别在不同的实验室用不同的生物做实验发现染色体末端结构对保持染色体的稳定十分重要，Muller将这一结构命名为端粒（telomere）。直到1985年Greider等从四膜虫中真正证实了端粒的结构为极简单的6个核苷酸TTAGGG序列的多次重复后发现了端粒酶(telomeraseTRAP-eze)。在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之所以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长度的特殊机制，体细胞可能正是由于缺乏这种机制，它的染色体末端才面临着致死性缺失（deletion）的危险。因此在正常人体细胞间永生化细胞（immortalizedcells）及肿瘤细胞的转化过程中可能也存在着与生殖细胞类似的机制，但这一直末予证实。十多年来对端粒和端粒酶的结构与功能有了较深入的认识。一、人类染色体端粒及端粒酶：1972年JamesWatson提出了“复制末端问题”，复制DNA的DNA多聚酶并不能将线性染色体末端的DNA完全复制。也就是说在线性DNA复制时，DNA多聚酶留下染色体末端一段DNA（一段端粒）不复制。端粒DNA复制的特点是在每次DNA复制中，每条染色体的3‘端均有一段DNA无法得到复制，随着细胞每次分裂，染色体3’一末端将持续丧失50-200bp的DNA，因而细胞分裂具有一定的限度，即分裂寿命。所以端粒的长度可作为细胞的“分裂时钟”，反映细胞分裂能力。真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短，这个缩短的端粒再传给子细胞后，随细胞的再次分裂进一步缩短。随着每次细胞分裂，染色体末端逐渐缩短，细胞进入不可逆的抑制状态，直至细胞衰老，此过程即称为复制性衰老。人类体细胞遵循这个规则从细胞出生到衰老，单细胞生物遵循这个规则分裂后定有其它机制保持单细胞生物传代存活，生殖细胞亦如此，这些细胞怎样保持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢？科学家们发现端粒确实随着每次分裂而缩短，但也会被新合成的端粒片断再延长。科学家们怀疑，可能尚有末被发现的酶，该酶具有标准的DNA多聚酶所不具备的功能，能使已缩短的端粒延长，使科学家们兴奋的是到1985年首先在四膜虫中证实了这种能使端粒延长的酶—端粒酶的存在。端粒（telomere）是真核细胞线性染色体未端的一种特殊结构，由简单重复富含G碱基的DNA序列及端粒结合蛋白共同构成。人类染色体端粒序列已分离克隆，主要由5-15个kb的5`TTAGGG3`上千次的重复序列构成，它就像二顶帽子盖在染色体两端，能保持遗传信息的完整性，保护染色体免受重组和未端降解酶的作用，并提供一种可消耗的非编码序列以暂时缓解或取消复制问题所带来的染色体DNA的进行性缩短。大多数体细胞的端粒随周期性复制而逐渐缩短，最终达到一个临界点，细胞增殖停止、死亡，这可能是生命有限的重要原因之一。体细胞的端粒有限长度（telomererestrictionfragmentsTRFS）大多数明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末端所致。缺少端粒的染色体不能稳定存在，这是因为端粒DNA与结构蛋白形成的复合物如同染色体的一顶“帽子”，它既可保护染色体不被降解，又避免了端粒对端融合（end-endfusion）以及染色体的丧失，同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受损染色体。在生理情况下，端粒作为细胞“分裂时钟”能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。端粒酶（telomerase）催化端粒合成，是一种逆转录酶，能以自身的RNA为模板，反向合成—TTAGGG—，不断地加在DNA未端，肿瘤细胞能够不断地分裂增生，“端粒酶—RNA”结构的存在是先决条件。现认为，人的端粒酶RNA可分为两个区与引物作用：一个是模板区，含有与引物互补的11个核苷酸模板区序列为11nt(5`CUAACCCUAAC-3’）；另一个锚定区，与引物的5’端相配，为DNA链向3’端正核酶外延伸提供路径，而端粒酶中的蛋白质则起催化反应合成的作用。人类端粒酶RNA（humantelomeneseRNAhTR）是细胞端粒合成不可缺少的模板，若模板区突变，缺失或反义RNA可导致端粒的相应改变或丢失。经转染的细胞端粒序列发生改变，细胞即出现凋亡或分化。hTR非模板区序列或空间构象的变化也可使端粒酶失去活性。在胃癌及神经肿瘤的研究中已发现，hTR表达与细胞增殖密切相关。端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶，它可以维持端粒的长度，维持细胞增殖潜能。端粒酶由RNA和蛋白质两部分组成。以自身RNA为模板合成端粒酶重复序列，具有逆转录酶活性，它的活性不依赖于DNA聚合酶，对RNA酶、蛋白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。二、死亡期细胞假说与细胞永生化细胞获得永生必须克服两个危机期，M1（mortalitystage1）和M2（mortalitystage2）在M1期细胞对生长因子等失去反应，产生DNA合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点（cellcyclecheckpoints）发送细胞周期停止信号，DNA合成即告停止。细胞端粒开始缩短，并启动终止细胞分裂信号，正常人的双倍体细胞不能进一步分裂，开始衰老、死亡。一些癌基因SV40T抗原、抑癌基因P53，和Rb突变均能使M1期的机制被抑制,使细胞逃逸M1期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶仍为阴性，端粒继续缩短，经过20-30次分裂后，最终到达M2期。此时因端粒太短而致染色体极不稳定，于是大多数细胞退化死亡，极少数细胞由于激活了端粒酶，端粒功能得以恢复，染色体形态稳定，可以超越M2期使细胞永生化。端粒酶被抑制正常人体细胞端粒丢失M1期阻滞SV40T抗原细胞分裂停止Rb、P53与病毒蛋白结合、突变↓M1—M2期间隔永生化双着丝粒形成↓M2期退化染色体失稳端粒酶被激活细胞凋亡附图：端粒酶在人体细胞永生性转化中三、端粒酶与肿瘤发生端粒酶是最近肿瘤研究的热门话题。端粒酶具有使肿瘤细胞系继续复制生存的特点，成为近期生命科学界关心与研究的一个热点。端粒缺陷的染色体不稳定性通过促进半合子化（hemizygosing）、转位（tranlocation）、扩增及重组装而加速肿瘤进程。端粒磨耗（attrition）的最终结果是端粒酶的活化，以弥补端粒的丢失而使细胞无限增殖，成为永生细胞。因此端粒酶活化是肿瘤进入晚期，而且是细胞永生的关键一步。为什么在绝大多数永生细胞系可以表达端粒酶活性，而在非永生细胞则不能？为什么人类大多数体细胞中不能检测到端粒酶，而在一些肿瘤细胞中则能检测到端粒酶？近年来围绕这一问题展开了大量的研究，积累了丰富的资料，至今仍是一个值得探讨的领域。自从1994年Kim等创立TRAP法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到，如前列腺癌、乳癌、口腔癌、肺癌、肝癌、胃肠基质瘤、膀胱上皮细胞癌及AML急性髓性白血病。Shay等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的检测结果，总结了正常组织（196例），原位癌（410例），恶性肿瘤（2031例）和癌旁组织（690例）的端粒酶的阳性率，它们分别是0.5%、30%、85%和11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的阳性率为85.0%~95.0%，而对应的癌旁或良性病变组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱。因此，尽管有研究认为，端粒长度维持还可以借助于非端粒酶依赖模式，即ALT（altematireLengtheningoftelomere）机制，但其存在上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。美国学者在400多例来源于12种不同组织的原发肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8％，而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4％，说明端粒酶活性与肿瘤生物学行为密切相关。端粒酶阳性的肿瘤比阴性的肿瘤有更大的恶性倾向。通过PCR技术形成的端粒重复扩增技术检测前列腺癌，31例中有27例（87%）有高表达的酶活性，国内刘洪坤总结有84%前列腺癌中检测到端粒酶活性。端粒酶可能是保持前列腺癌细胞持续生长必须的酶，在细胞恶变过程中端粒酶激活是个非常重要的步骤。有学者用鼠皮肤做模型，进行化学诱导致癌，分析处于乳腺癌不同阶段的端粒酶活性，结果发现早期乳腺癌细胞是二倍体细胞，分化较好，而晚期乳腺癌则是非整倍体细胞且分化较差，同时端粒酶活性进行性增加，并伴随着基因水平的不稳定性。在随后的研究中也得出了相同的结论，表明人乳腺癌的进程与端粒酶的活化密切相关，提示端粒酶可以作为诊断乳腺癌的指标。美国学者在慢性髓性白血病（CML）和急性髓性白血病（AML）的端粒动力学研究中，用southern印迹法测量端粒长度，用stretch-PCR法测出端粒酶活性，在CML白细胞中，端粒酶活性非常低与正常组织相似。但若CML急性发作时，白细胞中端粒酶活性就表现为显著升高。表明CML由慢性到急性发作时，高度激活了端粒酶。通过对CML和AML病情进展研究，发现所有病例中肿瘤细胞的端粒与相应正常细胞相比都是缩短的，这可能是由于肿瘤细胞分裂次数远远大于正常细胞之故。端粒缩短和端粒酶激活的情况，人们称之为端粒危机，这是肿瘤细胞克隆繁衍的强大驱动力，促进肿瘤的发展。有些实体肿瘤细胞中端粒并末缩短而是延长出现了矛盾的现象。端粒危机的的假说有两种解释：1、由于大量正常细胞混迹于实体肿瘤样品中，因而用印迹转移分析法来检验端粒长度是不可信的。2、白血病与实体肿瘤细胞克隆繁衍机制不同。许多血液学的恶性肿瘤都不会在局部形成肿瘤，细胞的增殖和循环都是单细胞的，因此每一个白血病细胞都将竞争更有效的增殖，端粒酶在单个白血病细胞中的表达是强烈的，瘤细胞分裂快速，端粒缩短，使突变细胞在短期内形成群落。与此相反实体肿瘤位于一点而不移动，因此子代对于不同突变的竞争被其紧邻所限制。实体肿瘤中大多数成功的克隆将比白血病细胞有更稳定的遗传特性。因为位于特殊环境中的特殊表型必须保持相当长的时间才能克隆形成群落，所以实体肿瘤只有具备较长的端粒，才能有较稳定的遗传特性，具备“最好”的表型从而被选择，进而生长繁殖。附表人体组织中端粒酶活性肿瘤部位/类型与肿瘤邻近正常组织/良性病变肿瘤组织（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%）结肠0/45（0）22/23（95.6%）肝——1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）肾0/55（0）40/55（72.7%）神经母细胞瘤0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLLALL）——21/23（91.3%）脑——6/8（75%）其它（头顶部，Wilms瘤）8/93（8.6%）24/26(92.3)合计14/332（4.2%）365/430(84.8)端粒长度是维持细胞永生所必须，从正常→慢性肝炎→肝硬化→肝癌，端粒的长度进行性缩短，Tahara检测33例原发性肝癌，其中28例（84.4%）有端粒酶活性，而在肝炎和肝硬化中均有低活性的酶存在，提示端粒酶活化可能在原发性肝细胞癌癌变过程中起重要作用。更令人感兴趣的是乳腺细针穿刺标本，尿标本，膀胱和肠腔冲洗液脱落细胞的端粒酶活性检测中恶性肿瘤也有较高的阳性表达，这可能有助于肿瘤的早期诊断。Hiyama等对胃癌患者进行端粒酶研究发现，端粒酶阳性患者其病灶较阴性者大，淋巴结转移率也高，预后差。然而，端粒酶与恶性肿瘤之间是否平行还有着很大的分歧。Hiyama等研究发现端粒酶活性的高低与神经母细胞瘤预后相关，高者预后差，低者预后好，在肺癌中，端粒酶活性高低与恶性度有相关性，胃癌、乳癌亦有类似的结果报告，但胃癌的端粒酶活性与肿瘤病理分级、DNA倍体、分期和预后间未发现有相关性。胡震研究认为端粒酶活性与肾细胞癌的病理分级、临床分期有正相关系，而贾瑞鹏等报道认为端粒酶活性与临床分