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1第三章显微镜首页基本要求重点难点讲授学时内容提要1．基本要求1.1了解(1)了解显微镜技术的产生和发展现状(2)了解光学显微镜的常见故障及其排除方法1.2熟悉(1)熟悉临床常用显微镜的临床应用(2)熟悉光学显微镜的维护、调试与使用方法(3)熟悉扫描隧道显微镜的基本原理及特点(4)熟悉电子显微镜的临床应用1.3掌握(1)掌握光学显微镜的性能参数、基本原理和基本结构(2)掌握常用显微镜的基本原理、结构和特殊部件(3)掌握电子显微镜的类型和组成(4)掌握透射和扫描电子显微镜的基本原理及特点。2．重点难点2.1重点(1)光学显微镜的光学参数、基本原理和基本结构(2)临床常用显微镜的基本原理、结构和特殊部件(3)临床常用显微镜的性能、用途(4)光学显微镜的调试与使用方法(5)电子显微镜的类型和组成(6)透射电子显微镜、扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜的基本原理及特点2.2难点(1)临床常用显微镜的基本原理、结构和特殊部件(2)光学显微镜的性能参数2(3)透射电子显微镜、扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜的基本原理及特点3．讲授学时建议10~12学时4．内容提要4.1光学显微镜4.1.1光学显微镜的工作原理光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，供人们提取物质微细结构信息的光学仪器。显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。把焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜（objectlens），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜（ocularlens）。而相对于物镜的成像条件及最后二次成像于观察者的明视距离等条件的满足是通过仪器的机械调焦系统来实现的。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实像，然后此实像再被目镜作第二级放大，得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距离处。4.1.2光学显微镜的基本结构光学显微镜的基本结构包括光学系统和机械系统两大部分。光学系统是显微镜的主体部分，有包括物镜、目镜、聚光镜及反光镜等组成的照明装置。机械系统是为了保证光学系统的成像而配置的，包括调焦系统、载物台和物镜转换器等运动夹持部件以及底座、镜臂、镜筒等支持部件。一些特殊类型或高级显微镜还有一些附加装置。显微镜基本结构示意图34.1.3光学显微镜的性能参数放大率:显微镜的放大率(amplification)或称放大倍数是指显微镜经多次成像后最终所成(放大的)像的大小相对于原物体大小的比值。数值孔径：数值孔径(numericalaperture)又叫镜口率，是物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径角的一半(β)正弦值的乘积，通常缩写为NA。分辨率：显微镜的分辨率(distinguishability)又称为分辨本领(resolvingpower)，是指透镜能分辨两点之间的最小距离。视野：视野(visualfield)又称视场(field)，是指通过显微镜所能看到标本所在空间的范围。景深与焦长：景深(depthoffield)又称焦点深度，是指在成一幅清晰像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离称“景深”。景物不动，像平面沿光轴前后移动的距离称“焦长”。镜像亮度和清晰度：镜像亮度即显微镜的图像亮度的简称。镜像清晰度是指图像的轮廓清晰、衬度适中的程度。工作距离：工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本间满足工作要求的距离范围，与物镜的数值孔径成反比。4.2电子显微镜4.2.1电子显微镜的基本结构电子显微镜主要由电子光学系统、真空系统、供电系统、机械系统和观察显示系统等几部分组成。电子光学系统主要由电子透镜和电子枪组成。真空系统主要由机械泵、油扩散泵或离子泵、联动控制阀门、真空排气管道、空气过滤器和用于真空度指示的真空测量规等组成。供电系统包括高压电源、真空系统供电电源、透镜电源、辅助电源及安全保护系统的电源等。机械系统包括电镜座、标本室、磁屏蔽外壳、镜筒、制冷系统及控制工作台等。观察显示系统由荧光屏和照相室两部分组成。4.2.2电子显微镜的分类及其应用透射电子显微镜：透射电子显微镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50～100nm）。在生物医学中主要用于观察组织和细胞内的亚显微结构、蛋白质、核酸等大分子的形态结构及病毒的形态结构等，另外，透射电镜还是区分细胞凋亡与细胞坏死最可靠的方法。细菌细胞结构，鞭毛结构，放线菌的孢子结4构及孢子表面装饰物立体形状等超微结构的观察，都需用透射电子显微镜。透射电子显微镜的实体图扫描电子显微镜：扫描电子显微镜的工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。其分辨率一般为3nm～10nm，放大率为5倍～300000倍，加速电压为1kV～30kV，SEM的景深长、视野大、图像有立体感、样品制备简单、放大率范围广、能够观察较大样品的局部细微结构。扫描电镜可以观察到微观世界的立体形象,它的图像是三维的逼真反映出样品表面结构的凹凸不平，如细菌的形态，鞭毛大小结构，放线菌的孢子表面装饰物等。在生物医学上，扫描电镜主要用来观察组织、细胞表面或断裂面的显微和亚显微结构及较大的颗粒性样品(3nm～10nm)的表面形态结构。扫描隧道显微镜：扫描隧道显微镜是根据量子力学原理中的隧道效应和三维扫描而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加电压（2mV～2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流，通过隧道电流获取显微图像，而不需要光源和透镜。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1～0.2nm，纵向可达0.001nm，已达原子量级的分辨率。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术。普通电镜只能观察制作好的固体标本。利用扫描5隧道显微镜可直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列，特别适用于研究生物样品和在不同实验条件下对样品表面的评价。STM有两种工作方式，一种称为恒流扫描方式，即采用电子反馈线路控制隧道电流使其大小恒定，而用压电陶瓷管控制针尖的表面扫描路线保持间距不变，随着表面高低起伏而上下运动。另一种工作模式是恒高度工作，在对样品进行扫描过程中保持针尖的绝对高度不变；于是针尖与样品表面的局域距离将发生变化，隧道电流的大小也随着发生变化；通过计算机记录隧道电流的变化，并转换成图像信号显示出来，即得到了STM显微图像。4.3特殊光学显微镜4.3.1荧光显微镜荧光显微镜利用物质的荧光性识别物质。荧光物质把入射的紫外线变为可见光，使荧光显微镜对可见光成像，故可以采用常规的物镜和目镜。当辐射波长在3000以下时，应采用贵重的石英玻璃作载玻片，为避免试样上的灰尘或污点产生外来的荧光，被检试样必须十分清洁。为防止紫外线进入物镜，可以采用暗视场照明。荧光显微镜既可以观察固定的切片标本，而且可以进行活体染色观察。4.3.2相衬显微镜光线只有通过染色标本时其波长、振幅发生变化，人眼才能看见，但活细胞和未染色的标本由于光波长和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化，因此利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。可用来观察活细胞和未染色的标本。4.3.3倒置显微镜倒置显微镜(InvertedMicroscope)的组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。4.3.4暗视野显微镜暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4nm～200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。它可用来观察小于0.1μm物体的存在，这是其他光学显微镜观测不出来的。还可用来观察活细胞的运动，尤其是配合显微摄影技术，可记录一个细胞或细胞器的运动轨迹，借此可分析它的运动方向，乃至速度等。4.3.5偏光显微镜偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折射性(即可以使一束入射光经折射后分成两束折射光)6的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪器。偏光显微镜是在一般显微镜的基础上增添了使普通光转变成线偏振光和检测偏振光的装置或观察干涉图样的特殊透镜。即光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的起偏器）。偏光显微镜的载物台是可以旋转的。当载物台无样品时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线。而放入旋光性物质后，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。利用它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶原、染色体、卵巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤维等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过程。4.3.6激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。4.3.7紫外光显微镜使用紫外光源可以明显提高显微镜的分辨率，对于生物样品使用紫外光照明还具有独特的效果。细胞中的原生质对可见光几乎是不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大分子对紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光显微镜（ultravioletmicroscope）研究单个细胞的组成与变化情况。4.3.8干涉相衬显微镜干涉相衬显微镜利用偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器、棱镜、滑行器和检偏器。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中安装了石英Wollaston棱镜，可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起两束光发生光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜(滑行器)，把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置(检偏器)，检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，使二者发生干涉。干涉相衬显微镜的优点是能显示结构的三维立体投影影像，与相衬显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强，产生类似于浮雕的效果。它使细胞的内部结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，因此适合应用于显微操作技术。74.3.9近场扫描光学显微镜近场显微镜的微探头是一个中空的、针状的、顶部小于150nm，内孔直径为50nm的玻璃微管，管壁镀铝膜，最终使光线只能从直径为50nm（可见波长的1/10左右）的内孔射入，微管的尾部接上十分灵敏的光量子探测器测量进入内孔的光量。这种技术的理论分辨率极限约10nm。由于采用可见光对生物样品损害很少，而且既可以用在空气