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第九章生物大分子的分离与纯化技术9.1概述9.2蛋白质的反相色谱（RPC）9.3疏水相互作用色谱9.4亲合色谱9.5电泳分离技术9.6超离心技术简介第九章生物大分子的分离与纯化技术9.1概述生物大分子是指蛋白质(包括酶)、多聚糖和核酸类化合物，一般分子量从几千到几百万。它们广泛存在于各种生物体内，与各种生命活动息息相关。除了天然存在的外，还有生物工程培养和发酵的。生物大分子具有十分重要的生理功能和应用价值。研究生物大分子的结构、功能及应用已成为生命科学的一个关键问题。蛋白质药物及其他生物制品在医药方面有着十分重要的应用前景。不论从动植物和微生物体内提取或用生物工程制备的生物大分子产品，都是组成十分复杂的混合物，在使用前都要分离和纯化。9.1.1生物大分子分离纯化的特殊性1、要求产品保持其生物活性，也就是说要避免不可逆结构变化发生。2、多孔填料必须使用大孔径基质。3、生物大分子的色谱特性常不同于有机小分子。所以在选择色谱条件时不能随便套用小分子的条件。9.1.2生物大分子分离技术双水相萃取膜分离电泳法超离心技术色谱法（分离生物大分子的液相色谱法）离子交换色谱排阻色谱疏水相互作用色谱亲合色谱反相色谱（液相色谱中，分离性能最好的）盐析法其技术，参考前面章节其技术参见第七章。注意：固定相、流动相、PH值的选择本章以下的方法主要以蛋白质及酶为分离对象。9.2蛋白质的反相色谱（RPC）9.2.1分离机理蛋白质的反相色谱中：①用C4～C8烷基作配基（将配基键合在固定基质上作为固定相）为固定相，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流动相（流动相极性大于固定相）。②蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。③在水溶液中，疏水性基团有避开水而亲合其他疏水性基团的倾向，即溶质分子的非极性部分在水中倾向于与水的接触面减小，促进了其与填料（疏水性配基）的亲合。④不同的蛋白质在相同流动相中由于疏水基团多少、种类以及表面分布情况不同，与填料的亲合力也不同，从而得到分离。结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋白质就容易被洗脱。9.2.2色谱条件①固定相：常用C4～C8链烃作为配基（键合在固体基质上）为填料。孔径25～50nm。②流动相：水溶性有机溶剂（B液）（甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃）＋水（A液）＋强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸）洗脱能力增大加酸作用：∵－SiOH==－SiO-＋H+•蛋白质易与—SiO-结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右离解。•减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。③温度：常温④检测：用紫外检测器，检测波长280nm和220nm。•280nm检测中含有含苯环的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的蛋白质，一般蛋白质都含有苯环，所以280nm检测是普遍使用的波长。•220nm主要检测肽键；所以所有蛋白质普遍适用。•核酸可在260nm检测。⑤洗脱方式：梯度洗脱——逐渐增加洗脱强度。•有机小分子与蛋白质在反相色谱中的洗脱曲线不一样。以B液的百分含量和蛋白质的容量因子k′作图，发现蛋白质在图上有一突跃。即在某一区间内，B液含量的一个较小的变化会引起某个蛋白质容量因子很大的变化。在此区间内B液一个小的增大使k′很快减小，使蛋白质从基本上不移动到很快洗脱下来。不同蛋白质到达这突跃区时所需B液的浓度不同，从而可以得到分离。•蛋白质的分离一般就需要用梯度洗脱，否则有些蛋白质已达到突跃会很快被洗脱下来，有些蛋白质还远离突跃区，实际上无法被洗脱。而有机小分子的反相色谱中未发现此种突跃现象。实际工作中梯度洗脱时间约为20～60min，B液的变化速度约为每分钟5%～15%。9.2.3应用最大优点：分离度最高；最大缺点：容易使蛋白质变性失活。例子：人的胶原蛋白I型α1和α2键的色谱分离图9-1人的胶原蛋白I型α1和α2键的色谱分离9.3疏水相互作用色谱概念：用适度疏水性的配基作固定相，以盐水体系作流动相，用疏水作用来分离生物大分子化合物的液相色谱法，叫疏水相互作用色谱(HydrophobicInteractionChromatography,HIC)或疏水作用色谱。9.3.1分离原理在HIC中：固定相表面有疏水性基团，（如-CH2，-CH3，-ph等）。而蛋白质分子是一个外部有一亲水层包围，内部有疏水核的具有四级结构的复杂体系。蛋白质表面亲水性很强，但也有一些疏水性的基团，同时团状的蛋白质还存在疏水基团较多的裂隙。在不同的介质中裂隙的伸展和收缩程度不同，从而使疏水基团暴露的多少也不同。疏水色谱是利用盐水体系中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之间疏水作用力的不同而达到分离的目的。CH3PhOHOCH2CH3NH2PhCOOHOH蛋白质蛋白质疏水基团分布示意图配基和蛋白质分子之间的吸附推动力和样品组分的洗脱机理（即：溶质在色谱中的保留行为）：•用“疏溶剂化理论”：蛋白质与配基的结合是由于溶质分子有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向，它们在盐水溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。溶质和疏水配基的结合是伴随着它们非极性表面暴露在水中的面积的多少而进行的。（即蛋白质在盐水体系中，有一倾向产生：避开水相而吸附在固定相上。∵生物物质界面自由能比水低，与表面自由能低的固定相产生亲合力）在疏水作用色谱中，溶质的容量因子K’与流动相盐浓度等因素的关系：lnK'=lnK'0+SC盐纯水中蛋白质的容量因子常数盐的摩尔浓度从盐考虑：讨论可见：盐的摩尔浓度增大，蛋白质在HIC柱上的保留长。结论均为常数水的摩尔浓度从水考虑：lnK'=lnI－ZlnC水lnI与Z大小反映了蛋白质疏水性的大小和洗脱的难易。疏水性大，保留值也大。水浓度增大，保留时间缩短。疏水作用色谱中，蛋白质在固定相上的保留性质是四个可变因素综合作用的结果。这四个因素是：样品分子、填料、流动相组成及性质和温度。9.3.2填料由基质和键合在基质上的配基两部分组成。（基质＋配基）基质：有“软”、“硬”两类，它们必须有25～100nm的内孔径或者有较大间隙的网状结构（孔径要大）。软基质：交联琼脂糖凝胶，交联葡聚糖凝胶、高分子聚合物。硬基质：主要是大孔径硅胶。配基：是一些含氮和氧原子的中等疏水性基团；or是丁基、苯基这些疏水基团键合在一个亲水性表面。9.3.3色谱条件主要有：a.具有中等疏水性表面的填料；b.盐析性盐的水溶液为流动相；c.紫外检测器检测，检测波长220或280nm，核酸在260nm；d.流动相pH值接近中性；e.由高盐浓度到低盐浓度的梯度洗脱，梯度时间20～60min；f.常温或4℃下操作。1、流动相的组成•有A液和B液两种。•A液：疏水性浓盐水溶液，并含有缓冲液作用的盐以稳定pH值。常用的A液为1.0～3.0mol/L(NH4)2SO4加0.01～0.05mol/L磷酸盐缓冲液；•B液：稀的缓冲液，浓度与A液中的缓冲作用的盐的浓度相等。常用的B液为0.01～0.05mol/L磷酸盐缓冲液。•盐有两类。•盐析性盐：使蛋白质的构象稳定，会促进蛋白质自身间的疏水作用而析出，or促进蛋白质与配基之间的疏水作用而保留在柱上。不失活，溶解度减小。常用：(NH4)2SO4•盐溶性盐：提高蛋白质的水溶性，同时会使蛋白质变性。如硫氰酸盐、盐酸胍等会。2、流动相的pH值一般地pH4～8；常选pH7左右。3、温度一般在常温或低于常温下操作。HIC中蛋白质的保留对温度较敏感。①在HIC体系中蛋白质处在活性状态，T↑使蛋白质的团状结构伸展，暴露出更多的疏水基团，疏水作用增强，保留值增大。（其他色谱，T↑保留增大）②T↑传质加快，使保留减小。（对所有色谱均适用）总之，在疏水色谱中，①比②大，∴T↑，保留增大。4、洗脱方式梯度洗脱。（高浓度盐→低浓度盐）9.3.4疏水作用色谱的应用•只用于生物大分子的分离，不用于有机小分子分离。•优点：首先是其色谱条件温和，蛋白质活性回收率高，一般都在85%以上。其次是不用有毒和昂贵的有机溶剂。第三是分离性能好。第四含高浓度盐的样品可以直接进疏水作用色谱柱进行分离。第五对生物工程产品的粗品可直接上样，一次完成蛋白质的初步分离、脱盐和复性三个目的。例如：基因重组人干扰素r是一种基因工程产品，其粗品是7mol/L盐酸胍溶液。干扰素在盐酸胍溶液中处于可逆性失活状态。因盐浓度太高无法直接上其他柱，除去盐酸胍后干扰素又容易析出来。若使用疏水作用色谱柱，将此样品直接进样，既脱除了盐酸胍，又达到了复性的效果。而且一步分离后，干扰素纯度可达到90%。图9-2IFN-r粗品的HIC分离疏水作用色谱与反相色谱的区别•相同：蛋白质与填料之间的保留是疏水力作用的结果。•区别：填料不同（HIC，表面中等疏水性作为配基；RPC，表面是烷基C4－8等疏水性强的为配基。）疏水力不同（HIC，疏水作用较弱；RPC，强）。水溶性有机溶剂水盐析性盐反相色谱洗脱液疏水作用色谱洗脱液使溶质与填料的疏水作用减弱，洗脱加强使溶质与填料的疏水作用增强，保留加大保留强洗脱强两色谱中洗脱液主要成分不同（正是上面的差异引起的）∴在HIC中可以加入少量有机溶剂以增强流动相的洗脱能力；在RPC中加入盐来改变蛋白质的保留值9.4亲合色谱(AffinityChromatography)AC9.4.1亲合色谱的原理•AC是吸附色谱的一种。但溶质的保留是一种特异的有选择性的亲合力。填料只是有选择地对一种生物大分子或一类生物大分子有吸附，对其他物质无吸附作用，洗脱时先被分离，分段洗脱或梯度洗脱再将生物大分子从填料上洗脱下来，从而达到分离目的。亲合色谱填料：是在基质上键合一个特殊的配基（配位体）制得。例如酶的底物、产物、抑制剂、辅酶、变构效应物，抗物的抗原，激素的结合蛋白等都可以作为配位体用于分离对应的酶，抗体和激素。有些配体可以用于一类化合物的吸附分离。如伴刀豆球蛋白可以特异地吸附糖蛋白；三嗪染料作配基也会对某些蛋白质有选择性吸附。配体与分离对象的作用：是一种特异的生物亲合力，是配体与被吸物之间范德华力、疏水力、静电力和其他力的综合作用的结果。这种综合作用力是有选择性的，只对一个或一类生物大分子起作用，对其他物质不起作用。故AC选择性很高。9.4.2填料（由基质、间隔臂和配体三部分组成）间隔臂作用：使配体伸离基质表面一定距离，即克服空间位阻，使配体与生物大分子容易接近和作用。一般为：4～6个亚甲基。配体要求：①对被分离生物大分子应具有高的生物特异吸附作用；②与基质或间隔臂之间要用化学反应形成共价键。基质要求：多孔或网络型凝胶结构外径25～100nm。亲合色谱填料示意图及说明AC填料的基质：分两类。一类为有机聚合物，用得最多的是多糖聚合物，如纤维素，交联葡聚糖、交联琼脂糖等。还有聚丙烯酰胺也是一类常用的基质。多糖基质表面羟基密度大，易制得柱容大的填料，而且其表面羟基对蛋白质无非特异性吸附。但这类基质机械强度低，不耐高压。第二类基质是多孔玻璃和硅胶。这类基质机械强度高，但柱容较小，表面硅羟基的非特异性吸附难以完全克服。9.4.3实验技术1、装柱•柱子有玻璃柱和不锈钢柱两种。软基质填料装在玻璃柱内，用于常压色谱。硅胶和多孔玻璃基质填料可装在不锈钢柱内用在高效液相色谱上。•玻璃柱采用普通的湿法装柱，溶剂应不损害配体的活体，一般用缓冲溶液作分散剂来装柱。•不锈钢柱一般采用匀浆法装柱，但装柱压力要低一些。分散剂常用亲水的醇类。2、洗脱方式•AC最常用的洗脱方式是分段洗脱，还有脉冲洗脱和梯度洗脱。•分段洗脱的过程是：平衡柱子(平衡液)→上样→平衡液洗涤→洗脱液洗下目标蛋白→再生→平衡→第二次上样•脉冲洗脱是在平衡、上样、洗涤后，用一段少量的洗涤液让其象一条密集的脉冲带流过柱子，以洗下某个特定的蛋白。3、流动相（有平衡液和洗脱液两种）•平衡液：起平衡柱子和上样后洗去不吸附的杂蛋白及其他杂质的作用。其成分是稀盐缓冲溶液。•洗脱液：是使吸附在柱子上的蛋白质解吸的流动相。分：•非特异性洗脱：利用洗脱液的组成、浓度、pH值和温度的改变使蛋白质与配体作用减弱而洗脱下来。•特异