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徐小文NF-κB信号通路主要内容★背景介绍★IKK复合物的上游信号★IκB激酶的结构和激活方式★IκB蛋白的作用★NF-κB的转录调节一.背景介绍1.NF-κB信号通路2.NF-κB家族3.IκB蛋白家族4.IκB激酶复合物5.NF-κB信号通路激活对肿瘤发生发展的影响背景NF-κB信号通路最基本的NF-κB信号通路，包括受体和受体近端信号衔接蛋白，IκB激酶复合物，IκB蛋白和NF-κB二聚体。当细胞受到各种胞内外刺激后，IκB激酶被激活，从而导致IκB蛋白磷酸化，泛素化，然后IκB蛋白被降解，NF-κB二聚体得到释放。然后NF-κB二聚体通过各种翻译后的修饰作用而被进一步激活，并转移到细胞核中。在细胞核里，它与目的基因结合，以促进目的基因的转录。NF-κB经典和非经典通路NF-κB的经典信号通路和非经典信号通路的主要区别就在于：☆在NF-κB的经典信号通路中，IκB蛋白的降解使NF-κB二聚体得到释放。☆而在NF-κB非经典信号通路中，则是通过P100到P52的加工处理，使信号通路激活。NF-κB家族背景2NF-κB家族由P50、P52、P65、c-Rel和RelB五个成员组成。它们分别由NFKB1,NFKB2,RELA,REL和RELB基因进行编码。它们都具有一个N端Rel同源结构域（RHD），负责其与DNA结合以及二聚化。另外,在P65、c-Rel和RelB中，存在着转录激活区域——TAD，对基因表达起正向调节的作用。P50和P52不存在转录激活区域，它们的同型二聚体可以抑制转录。背景3IκB蛋白家族IκB蛋白家族包括七个成员：IκBα、IκBβ、IκBζ、IκBε、Bcl-3、p100和p105。作用：在细胞质中与NF-κB二聚体结合，并对信号应答具有重要作用。IκB蛋白的结构特点：存在锚蛋白重复区域（即多个紧密相连的钩状重复序列，每个重复序列含有33个氨基酸）。背景4IκB激酶复合物IKKα/IKK1(CHUK)IKKβ/IKK2(IKBKB)调节亚基NEMO☺在特定的NF-κB信号通路中，IKKα和IKKβ是选择性需求的。背景5NF-κB信号通路激活对肿瘤发生发展的影响1.NF-κB信号通路激活对肿瘤发生发展的促进作用。※NF-κB所致的GADD45α和γ（生长抑制DNA损伤基因）联合表达下调是很多肿瘤细胞逃逸凋亡机制的关键步骤。※NF-κB还可上调CyclinD1（CCNDI）等基因的表达,促进细胞生长。※NF-κB激活对肿瘤的转移具有明显的促进作用。2.NF-κB信号通路激活对肿瘤发生发展的抑制作用。※RelA(p65)亚基在p53-介导的凋亡过程中具有重要作用很多胞外刺激信号都可以引起NF-κB信号通路的激活,如：促炎症细胞因子TNF-α、白介素IL-1,细菌脂多糖(LPS),T细胞及B细胞有丝分裂原,病毒双链RNA以及各种物理和化学压力等。虽然这些胞外刺激所产生的胞内早期信号途径各不相同，但一般认为,大多数此类胞外刺激起始的信号传递反应将最终激活IKK复合物。在这个传递过程中，衔接蛋白起着重要的作用。二.IKK复合物的上游信号在很多NF-κB信号通路中，许多的信号中间物都是共有的，特别是IKK复合物的上游信号。不同的信号通路可利用一些共有的信号元件激活和抑制通路。TRAFs——TNF受体相关因子IKK复合物的上游信号衔接蛋白RIPs——受体作用蛋白TAK1——TGFβ-激活性激酶1IKK复合物的激酶NIK——NF-κB诱导激酶1.TRAFs——TNF受体相关因子▲TNF受体相关因子TRAFs家族成员是一大类胞内接头蛋白，能直接或间接与多种TNF和IL-1/Toll-like受体家族成员结合。介导多种下游信号通路的信号传导，其中包括NF-κB信号通路。从而影响细胞的生存、增殖、分化和死亡，并参与多个生物学过程的调控。▲在几乎所用的NF-κB信号通路中，TRAFs都是关键的信号中间物。☆TRAF蛋白家族：TRAF蛋白家族一共有7个成员，分别是TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRAF7。TRAF蛋白质在结构上具有很高的同源性，同源性一般大于30%，其特征性的结构是所有成员在羧基端都有一个C-末端TRAF结构域，即包括一个卷曲螺旋结构，介导同型和异型蛋白之间的相互作用。另外，TRAF2-7的N-末端存在一个RING指结构，其可以作为E3泛素连接酶起作用，即将泛素转移到目的蛋白上。RING指结构后还有5到7个锌指结构域TRAF蛋白的结构TRAFS的功能1通过TRADD，TRAF2和TNF-α的受体TNFR1结合，向下传递信号，激活IKK。在此过程中，其RING指区域作为E3连接酶是必须的。但是其具体作用机制还需要深入研究。在TNFR1信号通路中，单一的敲除TRAF2或TRAF5，NF-κB信号通路的激活仍会出现。但是双敲除TRAF2和TRAF5，则会造成NF-κB信号通路中，IKK复合物的激活出现缺陷。因此，在TNFR1信号通路中，需要TRAF2和TRAF5的共同作用。在Toll-like／IL-1信号通路中，TRAF6可与受体复合物发生作用，激活IKK。但是，TRAF6的E3连接酶作用机制也是需要进一步证明的。因此，在NF-κB信号通路中，TRAF2、TRAF5和TRAF6在激活IKK复合物方面起着重要的作用。22.RIPs——受体作用蛋白☆RIPs是经典NF-κB信号途径中的关键的衔接蛋白。☆RIPs既可以通过蛋白结合区域直接作用于信号通路的上游，也可以通过与NEMO结合激活IKK复合物。并且，在大多数的TRAF依赖型信号通路中，RIPs都被牵涉其中。☆RIP蛋白家族一共有7个成员，分别为RIP1-7。☆RIP蛋白的结构特征是：都具有保守的丝氨酸/苏氨酸激酶区域。对于NF-κB信号通路的激活，IKK是非常重要的。因此，了解IKK活性的调节已经成为掌握NF-κB信号通路激活的核心。★1.IKK复合物★2.IKK的激活★3.IKK的酶作用底物三.IκB激酶的结构和激活方式1.IKK复合物＊IKKα（又称IKK1），85kD＊IKKβ（又称IKK2），87kD＊NEMO（又称IKKγ），48kD具有较高的序列同源性和相似的结构。在N-末端均含有蛋白激酶区,靠近中间区域的亮氨酸拉链区(LZ)及螺旋-环-螺旋(HLH)包括大段的卷曲螺旋(coiled-coil)及靠近C-末端的亮氨酸拉链区虽然一些实验证明在IKK复合物中，可能会含有一些其他成分，,如IKK关联蛋白1(IKKAP1)、促分裂原活化蛋白激酶1(MEKK1)、NF-κB诱导激酶(NIK)及调节蛋白IKAP等，但是需要进一步的证明。IKK复合物的组成：IKK复合物各组分的作用IKKα：在经典的NF-κB信号途径中，IKKα并不是必需的。它在NF-κB受体活化因子(receptoractivatorofNF-κB,RANK)引起NF-κB活化转导途径及NF-κB活化变更途径中是必需的。IKKα的缺失可导致许多发育上的缺陷。IKKβ：IKKβ是促炎症反应因子刺激诱导NF-κB的激活的主要激酶。IKKβ缺陷的细胞对TNFα和IL-1等刺激不会引起NF-κB的活化。IKKβ的活化是避免因局部缺血或充血引起严重炎症反应而导致多组织功能丧失所必需的。NEMO：在经典的NF-κB信号通路中，NEMO是必需的。NEMO可能通过与IKKβ和IKKα的直接作用而介导IKK复合物的组装,并且还能促进IκB蛋白与IKK激酶复合物的相互作用。IKK复合物的组装IKKα、IKKβ和NEMO共同组成了IKK复合物——(NEMO2IKKα1IKKβ1)2。IKKα和IKKβ可通过亮氨酸拉链区域形成二聚体，即IKKα：IKKβ异型二聚体。其实IKKα和IKKβ也具有其同型二聚体，但是在正常情况下很难存在。通过IKKC-末端的NBD区域，IKKα和IKKβ可与NEMO结合，结合的部位是第一个卷曲螺旋结构的47-80残基。其中，IKKβ与NEMO结合的亲和力要高于IKKα。虽然，IKK复合物的核心构成只包括IKKα/IKKβ/NEMO，但是其中还有两个很重要的特征需要我们注意：①激酶伴侣蛋白HSP-90/Cdc37。研究证明，伴侣蛋白HSP-90是与IKK复合物结合的，同时伴侣蛋白HSP-90的抑制物会抑制IKK复合物的激活，因此，可以说IKK复合物的激活是需要HSP-90的。由于HSP-90还与NF-κB信号通路中的其他激酶结合，Cdc37已经渐渐取代了HSP-90在IKK复合物的激活中发挥作用。②ELKS（转录激活因子ETS样蛋白）。其作为一个IKK复合物的调节成分。但是其对IKK复合物的重要性还需要进一步证明。2.IKK的激活★IKK复合物的激活首先是需要IKK亚基的T环丝氨酸的磷酸化。但是目前这种磷酸化的机制并不明确。其中，IKKβ的磷酸化位点是丝氨酸177和181，IKKα的磷酸化位点是丝氨酸176和180。另外，激活的T环丝氨酸如果突变成谷氨酸则会产生IKK激活，而突变成丙氨酸则会取消信号应答。★IKK复合物的激活中一个普遍的元素是：对TRAF家族成员的需要和诱导TRAF的寡聚化从而向下传递信号。这说明信号复合物的集合对于IKK的激活的重要性。★NEMO的C-末端区域介导IKK的激活。被RIP1介导的NEMO的可诱导的寡聚化被认为可以激活IKK，并且这一点已经得到了证明。但是，根据以上的发现，我们并不能得到IKK激活的具体机制。IKK激活需要的条件最近的一些发现为我们在研究IKK的激活的机制上提供了线索：①②③在酵母中，野生型的IKKβ表达的激酶活性被NEMO的共表达所提高，而那些T环被突变成谷氨酸的IKK，其活性也很高，但是其活性不会随着NEMO的共表达发生变化。说明：IKK的激酶活性被NEMO所提高，是通过IKK的T环磷酸化促进而发生的。研究发现，反式自磷酸化作为NEMO和IKK的一种本能的高次结构构成结果而发生，其展开的分子量近似激活的IKK。说明：反式自磷酸化可能是IKK激活的主要机制。IKK的NBD区域的丝氨酸残基的磷酸化，可以抑制IKK的活性，和阻止通过与NEMO的共表达而发挥作用的IKK活性的增加。说明：NBD/NEMO之间的作用对于NEMO介导的IKK激活很重要。IKK激活机制的探索因此，我们可以知道在IKK激活中，反式自磷酸化是主要的作用机制。IKK激活途径可能是一个反馈调节的重要机制。接受刺激后，NEMO与IKK的结合区域被磷酸化，磷酸化位点为丝氨酸68。这个磷酸化可诱导NEMO二聚体的分离，和阻碍IKK与NEMO之间的相互作用，从而终止信号通路。这种构象的变化可被伴侣分子HSP-90或IKK复合物的磷酸化酶所识别，通过HSP-90或者NEMO在丝氨酸68的脱磷酸化的作用，可以使IKK复合物恢复活性。IKK激活的反馈调节IKK的激活模型☆1.在静息状态下，(NEMO2IKKα1IKKβ1)复合物中，IKKs通过与NEMO相互作用而被抑制。☆2.在有刺激物的情况下，NEMO结合一个RIP蛋白（NEMO泛素化），使IKK的蛋白激酶区域暴露，诱导T环丝氨酸残基的反式自磷酸化或者由IKK-K磷酸化T环丝氨酸残基。☆3.被激活的IKK可磷酸化下游的酶作用底物（如IκBs），从而激活NF-κB信号通路。被激活的IKK还可磷酸化IKKβ的丝氨酸740和NEMO的丝氨酸68,使得NEMO二聚体与IKK的分离,阻止激酶的反复激活。☆4.Cdc37/HSP-90（伴侣分子）和PP2A/PP2Cβ（磷酸化酶）可以介导IKK复合物的重组。IκB蛋白的主要作用是掩盖NF-κB的核定位信号，阻止其入核，及其与DNA的结合，使NF-κB以非活化形式存在于细胞的胞质中。因此，对于研究NF-κB信号通路来说，IκB蛋白的研究很重要。★典型的IκB蛋白——IκBα,IκBε和IκBβ★前体IκB蛋白——p100和p105★非典型的IκB蛋白——IκBζ和Bcl-3四.IκB蛋白的作用随着NF-κB信号通路的深入研究，人们渐渐将重点转移到NF-κB