第19章色谱法分离的基本原理

III篇分离方法第19章色谱法分离原理19-1概述色谱法(Chromatography)与蒸馏、重结晶、溶剂萃取、化学沉淀及电解沉积法一样是一种分离分析方法。色谱法由俄国植物学家茨维特(Tsweet)早在1903年创立。茨维特在研究植物叶子的色素成分时，将植物叶子的石油醚萃取物，倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分在玻璃管内互相分离，形成不同颜色的谱带，因看到色带与光谱一样，因此取名为色谱法。茨维特认为这是一种很好的分离方法，特别适合于易分解的植物成分，以后此法逐渐应用于无色物质的分离，现在“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下流动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。色谱法的分类按相系统的形式与特征分为柱色谱、平板色谱。固定相装于柱内流动相依靠重力或外加压力的作用使其流动并达到色谱分离的方法，称为柱色谱。固定相均匀的铺在玻璃板上或直接利用多孔滤纸作固定相，流动相借助毛细现象或重力作用达到色谱分离的方法，因这类方法固定相呈平板状，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。依据两相物理状态分类依据流动相的物理状态分为：气相色谱（GC）；液相色谱（LC)；超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）。气相色谱又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）。液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）按色谱动力学过程，可将色谱法分为：迎头法、顶替法和洗脱法色谱法。洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。其流出曲线为tC顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。AA+B按分离原理分类利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。19-2线性洗脱色谱及有关术语洗脱色谱是基于样品组分在固定相和流动相之间达到分配平衡，并随着流动相向前流动时，反复多次的达到这种分配平衡。由于这个过程涉及到两相之间的分配平衡，所以可以用分配系数K来进行定量讨论。分配系数K指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值。msCCK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度分配等温线图19-1是溶质在固定相和流动相中之间的分配等温线。若分配系数K与浓度无关，则分配等温线是线性（图中C线）所进行的色谱过程为线性色谱。A、B型曲线是一条典型的吸附等温线。吸附色谱法属于这类线曲。从图19-1可以看出，溶质浓度低时Cs基本上正比于Cm，曲线近似于直线，一般情况下由于色谱柱中溶质的浓度较低．因此可以认为K为常数。K为常数时所进行的色谱过程称为线性色谱。容易理解，溶质流过色谱柱时，分配系数K值大，则保留时间就长，分配系数K值小，则保留时间就短。由于不同的组分这种分配系数上的差异，产生流动的速率不同，最终实现组分的分离。色谱法常用术语（一）色谱流出曲线和色谱峰由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。色谱流出曲线和色谱峰（二）基线色谱柱后仅有流动相流出，并通过检测器检测的信号。稳定的基线应该是一条水平直线。（三）峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示。（四）保留值1.死时间tM不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与t0的比值计算，即MtLu2.保留时间tR试样从进样开始到柱后出现峰极大值时所经过的时间，称为保留时间。3.调整保留时间tR´某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即tR´=tRtM由于组分在色谱柱中的保留时间tM包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tM实际上是组分在固定相中保留的总时间。保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。4.相对保留值2,1某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。2,1=tR2/tR1´由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号表示，即=tR(i)/tR(s)式中tR(i)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。（五）区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，它直接反映了色谱操作条件的动力学因素，某时间点上的色谱峰的区域宽度越小，对组分的分离越有利，因此该项指标可用于衡量色谱柱的分离效率。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。标准偏差、半峰宽W1/2、峰底宽度W。1.标准偏差当色谱峰为高斯曲线时，标准偏差可衡量，该曲线的离散程度。理论上0.607倍峰高处色谱峰宽的一半刚好等于标准偏差。2.半峰宽Y1/2即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为Y1/2=2.3543.峰底宽度Y即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是Y=4从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(v)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。（六）分配比k分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即msnnk量组分在流动相中物质的量组分在固定相中物质的mmssmsVCVCnnk式中Cs，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。分配比k是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数，k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。分配比k值可直接从色谱图中测得（推导过程教材P.351~352）。MRMMRtttttk'(19-10)分配系数K与分配比k的关系(推导过程P.352)KVVKVCVCkmsmmss(19-11)其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其β值一般为6~35；对毛细管柱，其β值为60~600。分配系数K及分配比k与选择因子α的关系对A、B两组分的选择因子，用下式表示：121212KKkk,(19-13)通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，α对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则2,1=1，两个组分的色谱峰必将重合。两组分的K或k值相差越大，则越可能分离得好。19-3色谱法基本理论图19-3示出了A、B两组分沿色谱柱移动时，分离与浓度扩散的基本情况。由图可知：溶质A和B在沿柱移动时，随着两组分在色谱柱中移动距离的增加有两种现象发生：两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，两峰间距离变大与区域扩宽是一对矛盾。若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：第一，两组分的分配系数必须有差异；第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。一个完善的色谱理论应该能够较好的建立起能准确描述这两种情况变化的数学模型。塔板理论与速率理论均以色谱过程中的分配系数恒定为前提分别从不同的角度讨论了色谱分离问题，故都称线性色谱理论。一、塔板理论将一根色谱柱比作一个精馏塔，即色谱柱的分离过程是在一系列连续、相等的水平塔板上进行的精馏。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。塔板理论假设：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：n=L/Hn称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。塔板理论指出：第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于50时，可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n值一般很大，如气相色谱柱的n约为103~106，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。式中tR与Y1/2(Y)应采用同一单位(时间或距离)。从公式可以看出，在tR一定时，如果色谱峰很窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。在实际工作中，由上式计算出来的n和H值，有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，没有扣除死时间tM。222116545)()(.YtYtnRR第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为：（19-17）有效板高：H有效=L/n有效因为在相同的色谱条件下，用不同的物质测量后计算出来的塔板数不一定相同。因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。222116545)()(.''YtYtnRR有效所以常用有效塔板数n有效表示柱效：（19-18）（19-19）例已知某组分峰的峰底宽为40s，保留时间为400s，计算此色谱柱的理论塔板数。解：n=16(tR/W)2=16(400/40)2=1600块例2P354塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数。但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。二、速率理论1956年荷兰学者vanDeemter（范第姆特）等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论——速率理论。他吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，