第15章细胞毒免疫学试验技术

第15章细胞毒免疫学试验技术免疫应答进行中，既有非特异杀伤细胞和特异性杀伤细胞，同时既有非特异细胞毒分子（因子），和特异性细胞毒因子，它们的免疫反应结果会导致靶细胞裂解死亡。一、癌细胞的杀伤研究：随着免疫学技术的发展，近年来对癌细胞杀伤的免疫效应报告甚多。大体为：1、非特异杀伤肿瘤细胞：如自然杀伤细胞（NK细胞）、K细胞，是体内抗肿瘤的第一道防线，NK可自发杀肿瘤细胞，K细胞依赖于抗肿瘤细胞的抗体存在而发生杀肿瘤效应。体外可用细胞毒试验方法来进行研究。通常采用51Cr释放试验来观察其杀伤效应。2、特异杀伤肿瘤细胞：人体内特异杀肿瘤细胞为TC（或TK）杀伤效应，该细胞的特异杀伤需要特异抗原预先致敏TC（或TK）细胞，以区别于非特异杀伤。3、某些淋巴因子的调节作用：近年来人们用IFN（特别是IFN-r）、IL-2等细胞因子来处理淋巴细胞均可大大增强NK、K、TC细胞等杀伤效应，特别是用IL-2培养癌症患者淋巴细胞可诱发和激活LAK等杀伤细胞，经体外增殖达一定量时再输回患者体内，可治疗晚期癌症。有关LAK细胞的制备和测定杀伤效应的方法见第三篇第四章。4、中草药对杀伤细胞的调节作用。中草药是祖国医药宝库。有许多补气类中草药及其提取物（如多糖或皂甙成分等）已在临床用于治疗肿瘤，体外细胞培养技术证明中草药中的人参、黄芪、刺五加、茯苓等均可促进细胞产生干扰素（IFN-r、β、α）、白细胞介素-2（IL-2）和增强NK、K、TC的杀伤效应。5、单克隆抗体的生物导弹作用：近年来已有许多癌细胞的单克隆抗体出现，若将杀肿瘤的毒性药物挂在抗体上，再将此抗体作为导弹输入患者体内，该抗体一旦与体内肿瘤细胞特异结合可发挥杀肿瘤效应。目前已在体外细胞培养中获得了许多证据，不久将指导用于临床。若与上述淋巴因子制成联合剂型可能效果更好。6、药物的毒性作用：为了筛选理想的癌细胞毒性物质或抑制物质如化疗药物，通常采用相应的癌细胞进行体外试验，以寻找最佳化疗药物和适宜的药物浓度，为临床用药提供依据。二、细胞毒试验：细胞毒试验是在组织培养中研究淋巴细胞、抗体或抗体依赖性淋巴细胞杀伤靶细胞的一种技术，也是在体外研究特异性细胞免疫比较可靠和灵敏的方法，目前微量细胞毒试验是应用最广的一种方法。(一)淋巴细胞对瘤细胞的细胞毒试验：(1)瘤细胞培养物制成悬液，并稀释至需要的细胞浓度。(2)于微量试验板的小孔内分别接种0.2ml瘤细胞(内含5×102个细胞)，37℃培育24小时。(3)细胞贴壁后，轻轻倾去培养液，加1mlPBS洗涤，倾去洗涤液及未贴壁细胞。(4)向小孔分别加入0.2ml淋巴细胞(分别含有5×105×104，5×103个细胞)，使淋巴细胞与瘤细胞之比依次为1000:1、100:1、10:1。(5)45分钟后加0.1ml5%胎牛血清，37℃继续培养2～3天。(6)2%台盼兰染色，翻转微量试验板，计数活存的瘤细胞，并设有正常人淋巴细胞代替肿瘤患者淋巴细胞作对照，每份需同时作三个复孔，分别检查各孔中活存细胞数，按下列公式计算细胞毒%，并作t检验。对照组小孔成活细胞数-试验孔成活细胞数细胞毒(%)=———————————————————————×100%对照组小孔成活细胞数(二)抗体加补体的细胞毒试验：此法是组织相容性（抗原HLA）检查技术中最常用的一种方法。也称微量淋巴细胞毒试验。人体的组织相容性抗原存在于淋巴细胞膜的表面，从供者与受者的血液分离淋巴细胞作为靶细胞，以各种定型单价抗血清与家兔血清补体作为效应系统。如果淋巴细胞表面具有与抗血清相对应的抗原，则淋巴细胞就会受损伤或致死而被台盼兰着色，方法如下：材料：淋巴细胞分离方法见前：血清：小牛血清(56℃30分钟灭活)待测血清：收集多产妇分娩时的胎盘剥离后的血，分出血清，叠氮钠防腐，4℃保存。已知阳性对照血清：用上海市中心血站制备的马抗人淋巴细胞血清(ALS)，同时作1:3稀释。补体：新鲜家兔混合血清，分装小试管，保存于-20℃。步骤：(1)在塑料试验盒(市售)内加入医用液体石蜡油20ml，放进一块52孔微量玻璃试验板，使板沉至盒底。(2)用0.25毫升的微量定量加液器分别加入待测血清和阳性对照血清2-3微升/孔，阴性对照用Hanks液代之。加样针尖应磨平。(3)用同法每孔内加入待测的淋巴细胞2～3微升，应先加阴性对照和补体对照孔，然后加待测孔，最后加阳性血清对照孔，加后轻摇使其混匀，置室温作用1小时。(4)每孔加入兔补体5-7微升(按加淋巴细胞顺序加入)，置37℃培育45分钟(或室温作用1小时)。(5)每孔加入2%台盼兰等渗液3-5微升静置室温中20分钟，吸去兰色上清液。(6)普通显微镜检查，记录每孔中死细胞(着色细胞)数。死细胞：体积稍大，着兰色，无折光性。活细胞：大小正常，未着色，较透亮。判断标准：（每次实验，需做3-6个复本）。其中着色细胞：≤20%阴性20%—50%弱阳性对照组小孔活存细胞数—试验孔活存细胞数细胞毒%=×100%对照组小孔活存细胞数50%—70%阳性≥70%强阳性(三)ADCC试验：抗体依赖细胞介导细胞毒用来检查K细胞的FC受体，该细胞结合抗体杀伤靶细胞的作用是无特异性的，故称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。操作方法参照下表2-11。表2-11ADCC试验操作法反应物试管号（ml）12345678951Cr标记靶细胞0.10.10.10.10.10.10.10.10.1抗血清0.10.10.10.10.10.1——0.1NP40稀释度1:101:1001:10001:101:1001:1000淋巴细胞0.80.80.8———0.8—0.8培养液———0.80.80.80.10.9—结果说明：①1、2、3号为试验管；②4、5、6号为对照管（抗体靶细胞）；③7号管为对照管（淋巴细胞，靶细胞）；④8号为靶细胞对照（自然释放率）；⑤9号管用NP40溶解靶细胞，为100%释放率；⑥为精确计算，每一份应作2～3套复管，取平均值，计算方法与NK细胞51Cr释放法类同。(四)NK细胞毒试验之一——51Cr释放法：效应细胞的制备：用常规的Ficoll分离法分离外周血中的单核细胞，经玻瓶37℃贴壁2小时，以除去单核——巨噬细胞，计数活细胞数，使细胞浓度为5×106/ml，细胞存活率为95%以上（小鼠可用鼠脾细胞）。靶细胞制备：取培养24—48小时的K562细胞（小鼠可用Yac-1细胞），1640培养液洗一次，用营养液配成4×106/0.5ml，加100uci51Cr,37℃水浴90分钟，隔15分钟摇匀一次，然后洗涤三次，除去游离的51Cr，计数活细胞，稀释细胞数达1×105/ml。NK活性测定用４小时短程释放法，自然杀伤组效靶细胞(50:1)各0.2ml，自然释放组以营养液代效应细胞，最大释放组以2%SDS液代效应细胞，分别置37℃接触4小时，然后各管加冷Hanks液0.6ml终止反应，离心(1000r/min)10分钟，吸上清0.5ml，用γ计数器测放射性（cpm）按下式计算：自然释放组cpm自然释放率(%)=————————×100%最大释放组cpm对照组小孔活存细胞数—试验孔活存细胞数细胞毒%=×100%对照组小孔活存细胞数试验组释放cpm-自然释放组cpm自然杀伤率(%)=————————————————×100%最大释放组cpm-自然释放组cpm标记细胞cpm靶细胞标记率(%)=————————=cpm/细胞被标记细胞数(五)NK细胞毒试验之二——3H-TdR法。取培养24-48小时的K562靶细胞，稀释至5×104/ml，效应细胞为人外周血单个核细胞，制成5×106/ml，细胞悬液，加入微板中，每孔加入靶细胞与效应细胞各0.1ml(效靶比例为100:1)，靶细胞自然掺入对照组仅加入靶细胞悬液0.1ml，用RPMI1640培养液0.1ml代替效应细胞，每组均设三复孔，加入细胞悬液后，每孔立即加入3H-TdRlμci，然后置37℃5%CO2中培养20小时，收集细胞于纤维滤纸上，用γ计数器测定cpm，用特异抑制百分率（Pi）表示NK活化，按下式计算：实验组cpmPi=（1-————————————）×100%靶细胞自然掺入率cpm(六)NKCF检测（MTT法）：培养三天的K562细胞经完全培养基洗涤一次后配成2.5×105/ml细胞悬液，在微孔培养板上加入50μl/孔，再加入含NKCF标本50μl/孔，标本不同稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16……，阴性对照为无NKCF的培养基，阳性对照为蒸馏水，每份标本设三个复孔取其平均值，另设一个无细胞空白对照孔。置37℃5%CO2培养箱中培养24小时，加MTT后的过程与活细胞检测基本相同，按下式计算各稀释度的NKCF值(见第一篇第九章)。标本（或阳性对照）阴性OD—标本（阳性）OD对K562细胞杀伤率(%)=————————————————×100%阴性OD标本杀伤率标本中NKCF杀伤活性=—————————×100%阳性对照杀伤率此外还有台盼兰排除法，通过计算细胞死亡率（或存活率）来表示NK细胞的杀伤活性方法简便易行，但有客观因素，对NK细胞的杀伤效应也可采用MTT法。(七)LAK细胞毒试验125I释放法LAK细胞的制备：经乙醚麻醉后，无菌取鼠脾脏，淋巴细胞经挤压后，用四层纱布过滤，自然释放组cpm自然释放率(%)=×100最大释放组cpm实验组cpmPi=(1——————————)×100%靶细胞自然掺入cpm对照组小孔活存细胞数—试验孔活存细胞数细胞毒%=×100%对照组小孔活存细胞数对照组小孔活存细胞数—试验孔活存细胞数细胞毒%=×100%对照组小孔活存细胞数经三次离心洗涤，制成细胞悬液，将浓度调整至107/ml，加IL-2制品1ml，置5%CO237℃孵育5天，存活的淋巴细胞可作为LAK细胞使用。LAK细胞体外细胞毒活性测定：用125I脱氧尿嘧啶核苷标记WBT-2M纤维肉瘤靶细胞，每106个细胞加125I尿嘧啶核苷4uci，37℃条件下静置培养14小时，接着用Hanks液三次离心，充分洗涤，然后分别与效应细胞（新鲜脾细胞，经5天培养的脾细胞，LAK细胞），置微量培养板中共同孵育6小时，吸取上清液：用γ计数器测定同位素的释放量，并依下列公式计算其细胞毒性的百分率（此法也可用3H-TdR掺入法和MTT法）：实验组释放量—自然释放量LAK细胞毒(%)=———————————————×100%最大释放量—自然释放量注：每组三个复管，各管均需减去本底cpm。(八)CTL的细胞毒试验：取淋巴细胞1×106/ml，经ConA3μg/ml刺激培养5日获效应CTL，靶细胞用125I-UdR标记的肥大细胞瘤P815细胞（DBA/2小鼠）或者为K562细胞，其方法为每孔加入50μlCTL，70μl含1×104的125I-UdR标记的P815细胞及30μl的1/25稀释的PHA（或12μg/孔以利诱导全部CTL起杀伤作用，微板经1200r/min5分钟后，37℃培养3.5小时后取出，再加入0.5%trypsin50μl再培养30分钟后以1200r/min离心，取每孔中上清100μ加入小玻璃管中，将每孔中的细胞收获于玻璃纤维纸上，用γ计数器分别测上清及细胞中的cpm值，按下式计算杀伤效应。全部上清cpm-(SR*cpm-BGcpm**)特异杀伤%=—————————————————×100全部上清cpm+细胞cpm-BGcpm*SR为不加CTL的自然释放对照组。**BG为仪器本底数MR为以每孔中加入0.1ml2%SDS，为细胞完全溶解的最大释放量。