溶菌酶作用机理研究

裂解酶PlySs2裂解细菌的作用机理研究1.实验目的PlySs2是从猪链球菌（Streptococcussuis）噬菌体中分离到的一种裂解酶，对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistantstreptococcusaureus,MRSA）、万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌（Vancomycin-intermediatestreptococcusaureus,VISA）、猪链球菌、李斯特菌（Listeria）、模仿葡萄球菌（Streptococcussimulans）等细菌具有抑制活性，活性高，抗菌谱广[1,2]。研究发现，PlySs2由两个功能结构域构成，即催化结构域（Catalyticdomain,CD,PlySc）和细胞壁结合结构域（Cellwallbindingdomain,CBD,PlySb）[1,2]。CBD结构域负责与细胞壁上相应基质结合，CD结构域侧催化相应的化学反应促使细胞壁上特定物质分解，从而破坏细胞壁结构并裂解细胞。PlySs2的N端为半胱氨酸-组氨酸氨基水解酶（Cysteine-histidineamidohydrolase/peptidase，CHAP）催化结构域，C端为SH35型结合结构域。CHAP结构域即具有丙氨酸酰胺酶活性，也具有肽桥内切酶活性[2]。研究发现，只有完整的PlySs2才能保持其较高的溶菌活性，PlySs2属于结合结构域PlySb依赖型，单独的催化结构域PlySc的溶解活性很小或者基本无活性[1]，说明PlySb对底物的识别十分重要。PlySs2能识别多种菌的细胞壁并产生裂解活性，但是不同菌之间存在活性差异，这即体现了其广谱性，又体现了活性差异性。相关报道表明，多数裂解酶与细菌细胞壁中肽聚糖的特定位点结合并破坏其结构，从而裂解细菌。不同菌株之间细胞壁的组成成分具有差异，导致裂解酶存在活性差异[3]。目前推测，PlySs2的结合位点在细胞壁肽聚糖上，并破坏其结构以裂解细菌。本研究的目的是找到PlySs2与肽聚糖相互作用的结合位点，分析PlySs2裂解细菌的作用机理。2.实验思路根据实验室已有的方法诱导表达和纯化PlySs2，备用。选择PlySs2裂解活性最高的金黄色葡萄球菌作为实验菌，在最适条件下培养并获得菌体。实验思路一：PlySs2直接与金黄色葡萄球菌相互作用。在最适条件下孵育PlySs2和金黄色葡萄球菌的混合物，离心并收集上清液。由于PlySs2与金黄色葡萄球菌细胞壁上某种物质相互结合并反应，可能存在PlySs2与底物结合在一起的复合物，离心后收集上清液，其中可能存在少量该复合物，再采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）检测分析。若与空白对照比较有特异性条带出现，回收产物并分析其中的物质成分。方法特点：简单易行，但可能上清液中PlySs2与底物结合的复合物含量较低，无法检测出来。实验思路二：PlySs2与金黄色葡萄球菌细胞壁相互作用。若实验思路一无法找到PlySs2的结合底物，则进一步提取金黄色葡萄球菌的细胞壁，直接让PlySs2与细胞壁反应，反应方式有两种：（1）在最适条件下孵育PlySs2和细胞壁的混合物，离心后收集上清液，采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）检测分析。若与空白对照比较有特异性条带出现，回收产物并分析其中的物质成分；（2）找到合适的方法固定PlySs2，然后让固定化的PlySs2与细胞壁反应，分离出固定化的PlySs2与细胞壁成分结合的复合物，再从PlySs2上解离出结合底物，收集底物并鉴定。方法特点：提高了PlySs2底物的浓度，减少了细胞内容物对结合反应的影响，但细胞壁提取过程中有可能破坏其天然结构，可能影响PlySs2与底物的结合，固定化PlySs2也有可能影响其结合位点的结合活性。实验思路三：PlySs2与金黄色葡萄球菌细胞壁单一成分相互作用。3.实验方法3.1.PlySs2的诱导表达和纯化PlySs2的诱导表达和纯化参考黄燕玲的毕业论文[4]。3.2.金黄色葡萄球菌细胞壁的提取和纯化采用超声波法提取细胞壁[5,6]，具体操作步骤如下。（1）菌体收集：在Baird-Parker培养基中培养金黄色葡萄球菌。培养完毕后，迅速降温至4℃（冰浴），在4℃下3000r/min离心20min，收集菌体沉淀。4℃蒸馏水反复洗涤菌体至白色，收集菌体，置于100℃沸水中灭活20min。（2）超声波细胞破碎：条件为超声功率400W、超声时间30min、超声温度40℃。（3）细胞壁收集：超声处理过的混合液在3000r/min下离心20min，去除未破碎的菌体沉淀，收集上清液，12000r/min离心15min，收集沉淀即为细胞壁。3.3.PlySs2与细胞壁的结合实验方法一：4.实验材料4.1.菌株和质粒PlySs2表达菌株：E.coliBL21（DE3）/pET28a-PlySs2；活性测试菌株：StreptococcusaureusB30/B31。均为本实验室保存。4.2.试剂和耗材4.3.培养基和溶液配制4.4.仪器5.实验预期结果参考文献[1]HUANGY,YANGH,YUJ,等.MoleculardissectionofphagelysinPlySs2:integrityofthecatalyticandcellwallbindingdomainsisessentialforitsbroadlyticactivity[J].VirologicaSinica,2015,30(1):45-51.[2]GILMERDB,SCHMITZJE,EULERCW,等.NovelBacteriophageLysinwithBroadLyticActivityProtectsagainstMixedInfectionbyStreptococcuspyogenesandMethicillin-ResistantStaphylococcusaureus[J].AntimicrobialAgentsandChemotherapy,2013,57(6):2743-50.[3]LUJZ,FUJIWARAT,KOMATSUZAWAH,等.Cellwall-targetingdomainofglycylglycineendopeptidasedistinguishesamongpeptidoglycancross-bridges[J].TheJournalofbiologicalchemistry,2006,281(1):549-58.[4]黄燕玲.噬菌体裂解酶PlySs2细胞壁结合功能域的鉴定与应用研究[D];中国科学院大学,2015.[5]MORSESI.STUDIESONCHEMISTRYANDIMMUNOCHEMISTRYOFCELLWALLSOFSTAPHYLOCOCCUSAUREUS[J].JournalofExperimentalMedicine,1962,116(2):229-&.[6]孙涛.嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的分离提取及其免疫活性的研究[D];吉林农业大学,2007.