搜索
溶菌酶的提纯结晶和活力测定姓名：学号：班级：指导老师：一、实验前言1.实验背景溶菌酶（lysozyme）是一种能够水解细胞壁成分中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键的酶，被广泛应用于医药、食品工业、生物工程等方面，现从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶已达到工业化生产水平。蛋清中的溶菌酶含量越高，酶活力越强，越有利于鸡蛋的保存，因此测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶对我国溶菌酶生产、禽蛋产品加工有重要的指导作用，也为蛋品质评定提供了一个重要参数。活力测定的基本原理是用一种细菌悬液作为基质,加入待测标本后保持一定时间,如样品中含有溶菌酶则细菌被溶解,即其细胞壁不溶性多糖变成可溶性粘肤。测定方法很多:如平皿测定法、光电比浊法、粘度测定法、分解产物测定法(因为底物往往过量,通常不用底物)、化学滴定法、分光光度法及同位素技术,其中以平皿测定法和比浊法最为常用。溶菌酶分布很广,而且不是单独存在的,往往是和许多因子共同作用、相互协调。同时,可以直接或间接地通过酶的分解产物而起作用。在这里许多问题正处于摸索阶段,有些方面通过特定的实验,预测其应用。而这些特定的实验往往对某种或某一个动物而言,还有其局限性。未定论的问题很多,许多应用尚未大面积使于临床,但是溶菌酶必将越来越引起人们的重视,特别是其广布于人体,在医药、科研方面的作用尤为重要.(l)抗菌溶菌酶不但作用于革兰氏阳性细菌,而且它作为一种非特异性免疫,即对所有的病原微生物都有一定程度的抵抗力,没有特殊的选择性,对身体的自然防御起很大作用.如鼻粘膜,口腔中含有一些溶菌酶,临床用于治疗副鼻窦炎和龋齿;眼泪和白血球中溶菌酶含量最高,因此在干燥综合症诊断上,认为泪液溶菌酶值的下降可以提供敏感可靠的指标,并能反映泪腺受损程度;在白血病患者的尿中,含有大量溶菌酶,临床上可有效地诊断白血病。白血球中的溶菌酶在脱颗粒过程中被排列到噬菌体内,噬菌体感染宿主(抗原)后,诱导产生溶菌酶(抗体),这种溶菌酶是噬菌体染色体组,通过细胞壁分解酶和膜多糖分解酶的作用而表现,其主要功能一是使噬菌体产生吸附作用,二是使噬菌体向宿主菌体内注入DNA,溶菌酶在噬菌体侵入宿主菌细胞和溶菌的整个过程中都起着重要作用,此溶菌酶(抗体)和补体共同作用,使某些微生物敏感,因此,溶菌酶可能和噬菌体内其他抗微生物系统有协同作用,主要作用是消化细菌,而不是杀死细菌。普遍认为,这种白细胞具有抗肿瘤作用和治疗由细菌、病毒引起的炎症。以上这种抗原—抗体反应也可以在体外进行溶菌反应,即血清学反应,可解析细菌表层结构和作为研究分子生物学的材料,通过它寻找新酶类,也可用做病毒性传染病的诊断。(2)抗病毒一方面如流行感冒和腺病毒,可能它的蛋白质外壳具有溶菌酶的作用点,现已证明,腺病毒在人体内引起呼吸道炎症,在实验动物中引起肿瘤。因此,用溶菌酶可以治疗呼吸道疾患,抗动物肿瘤。另一方面溶菌酶作用的细菌产物可诱发产生干扰素,而干扰素主要功能是抗病毒。(3)提高抗菌素疗效因为抗菌素是微生物合成的代谢产物,通过抑制细菌细胞壁肤聚糖及核酸和蛋白质的合成,影响细胞膜,因而具有抑制或致死其他微生物的作用。而溶菌酶也作用于细胞膜,与抗菌素合用可提高疗效。(4)组织修复一方面酞胺类溶菌酶已证明对细胞的生长、分裂起直接作用.另一方面溶菌酶作用的微生物细胞壁是含氮的多糖(叫粘多糖),它在组织生长和再生过程中起重要作用。日本学者在各种类型伤口的实验鼠中证明了溶菌酶的组织修复和临床治疗作用。(5)促进血凝实验证明:糖昔酶作用于鱼(节肢动物甲壳类),其分解产物一脂多糖具有凝胶化作用,通过激活凝血酶原,促进血凝,在人类临床上已用于牙科和泌尿科等小手术止血。(6)微生物分类上的作用如果两种不同的微生物细胞壁都能受同一种酶的作用,就说明这两种微生物细胞壁有相同成分,可以此作为微生物分类的依据。(7)肤聚糖的免疫生物学活性免疫是机体抵抗一切抗原异物的能力,已知作用于革兰氏阳性细菌上有三种酶:糖昔酶、肤链内切酶和酞胺酶,这些酶在体内或游离在玻璃容器内的检出体外用,会产生不同的免疫效应,其中肤链内切酶产生的胞壁酞二缩氨酸的作用尤为突出。最近日本学者研究发现溶菌酶可作为潜在检测金属免疫毒性的生物标志剂。(8)在分子遗传学方面的研究进展搞清溶菌酶基因的结构、诱导、表达及定位,对于开发和利用溶菌酶起很重要的作用,这正是现代分子生物学的发展方向。美国学者〔,3,研究昆虫的溶菌酶基因的结构和诱导,用CDNA进行Norhtern杂交证明脂肪含量最高。还有学者〔,们搞清了水牛中溶菌酶基因的染色体定位。美国学者还在转基因鼠乳腺中成功地表达了人溶菌酶mRNA。总之,溶菌酶是研究细胞学、生物化学、微生物学、遗传学、医学、药学、卫生学等方面的一种重要的水解酶。对溶菌酶的研究始于20世纪初，英国细菌学家弗莱明在1922年发现人的鼻涕、唾液、眼泪有强大的溶菌活性，并把其溶菌作用的因子命名为溶菌酶。此后研究者在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在，其中鸡蛋蛋清的溶菌酶含量最高（约含0.3%）。鸡蛋蛋清已成为溶菌酶生产的主要原料，但是蛋清中溶菌酶的定量测定还没有一个较便捷的方法，传统的方法是先提取蛋清中的溶菌酶，再测定提取液中的蛋白含量。由于不可能完全提取出蛋清中的溶菌酶，这种方法计算出的蛋清溶菌酶含量往往比实际的数值小。溶菌酶活力的测定方法很多，目前，国内常用的有琼脂板扩散法、比色法、高效液相色谱法等，而国外多用比浊法测定溶菌酶活力。测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶含量的传统途径是先提取再测定，从蛋清中分离纯化溶菌酶已有不少报道，虽然正交试验的酶回收率可达94%，但是再精确的提取途径也无法完全提取出蛋清中的溶菌酶。2.实验目的学习溶菌酶的提纯方法和酶活力的测定3.实验原理鸡蛋清内含有丰富的溶菌酶（lysozyme），向蛋清中加入一定量的中性盐，并调节pH至溶菌酶的等电区，溶菌酶即可结晶析出。如结晶不纯，可重结晶。溶菌酶之所以溶菌，是因为它能催化革兰氏阳性细菌细胞壁黏多糖水解。测定溶菌酶活力，可用某些细菌细胞壁作底物，以单位时间内被它水解的细胞壁的量表示酶活力的大小。二、主要仪器设备及试剂1.主要仪器设备可见分光光度计离心机恒温水浴锅匀浆器烧杯布氏漏斗真空干燥器纱布吸管量筒抽滤瓶电子天平2.主要试剂1.氯化钠（C.P）：应研细2.五氧化二磷3.1mol/LNaOH溶液4.丙酮（无水，C.P）5.0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）6.溶菌酶晶种7.牛肉膏蛋白胨固体、液体培养基8.底物悬液：溶菌小球菌（MicrococcuslysodeikLicus）的细胞壁三、实验步骤1．底物悬液的制作将菌种接种于液体培养基扩大培养（28℃,24h），离心（4000rpm，20min），倾去上清液，沉淀为菌体。加入少量蒸馏水，用玻璃棒搅成悬液，离心，倾去上清液，如此反复洗涤菌体数次，最后用少量蒸馏水制成悬液，冷冻干燥。亦可将菌体铺于玻板上吹干，刮下，置干燥器中。取干菌粉5mg，置匀浆器中，加入少量pH6.2磷酸缓冲液，研磨数分钟，倾出，用少量缓冲液洗匀浆器，一并稀释至20-25ml。比色测定A450nm。此悬液吸光度应在0.5-0.7范围内。2.溶菌酶的提纯结晶（1）将2只鸡蛋的蛋清置于小烧杯中（蛋清pH不得低于8.0），慢慢搅拌数分钟，使蛋清稠度均匀，然后用两层纱布滤去卵带或碎蛋壳，量记蛋清体积。（2）按100ml蛋清加5g氯化钠的比例，向蛋清内慢慢加入氯化钠细粉，边加边搅，使氯化钠及时溶解，避免氯化钠沉于容器底部，否则将因局部盐浓度过高而产生大量白色沉淀。（3）加完氯化钠，用1mol/LNaOH调节pH至9.5-10.0，随加随搅匀，避免局部过碱。加入少量溶菌酶结晶作为晶种，4℃放置数天。当肉眼观察有结晶形成后，吸取晶液一滴，置载玻片上，用显微镜观察（100×），记录晶形。（4）结晶用布氏漏斗滤得，用0℃丙酮洗涤数次，置真空干燥器干燥。3.活力测定（1）酶液的制备：准确称取干酶粉5mg，用0.1mol/LpH6.2磷酸缓冲液溶解成1mg/ml酶液。用时稀释20倍，则每毫升酶液酶量为50ug。（2）将酶液和底物悬液分别置25℃水浴中保温10-15min，然后吸底物悬液3.0ml置比色杯中，比色测定A450nm，此为零时读数。然后加入酶液0.2ml（10ug酶），迅速摇匀，从加入酶计时，每隔30s测一次A450nm，共测3次。（3）本实验的酶活力单位定义为：每分钟A450nm下降0.001为一个活力单位（25℃，pH6.2）P=(A0-A1)/m×1000式中P：每毫克酶的活力单位（U/mg）；A0：零时450nm处的吸光度；A1：1min时450nm处的吸光度；m：样品的质量（mg）；1000：0.001的倒数，即相当于除以0.001。四、实验结果分析1.晶形2.比色测定结果五、注意事项1.鸡蛋清的搅拌速度切忌不能起泡，搅拌方向不得改变，搅棒应光滑，这些都是防止蛋白变性的措施。2.氯化钠细粉应慢慢加入，并边加边搅，防止因局部盐浓度过高而产生大量白色沉淀。3.调pH时，氢氧化钠应随加随搅匀，避免局部过碱。4.底物悬液中加入酶液后应迅速摇匀并从加入酶液开始计时。六、参考文献1.《溶菌酶的提纯结晶和活力测定》ppt2.《溶菌酶及其应用》——张秀华王琳3.《测定鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力标准方法的建立》——侯启瑞，王金玉，谢凯舟，戴国俊，刘大林（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）七、致谢感谢组员的配合和老师的指导