蛋白的分离纯化详解

一、蛋白质的分离纯化概述与蛋白质分离纯化相关的理化特性•分子大小•分子形状•带电特性•溶解特性•与配体特异性结合不同•吸附性质•变性和复性哪些技术、原理分子大小重点•大小：蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数目。•常用方法–透析–超滤–凝胶过滤–离心分子形状重点•形状：蛋白质在离心通过溶液、膜、凝胶颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到它的形状的影响。•方法–密度梯度离心–电泳–分子筛层析（三格写，两格不写）电荷•原理：蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷总和。•方法–电泳–离子交换层析溶解度•原理：由于蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。•方法：–盐析法–有机溶剂沉淀法–等电点沉淀法配体特异性结合重点•原理：将具有亲和结合的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，来分离另一个分子。•分类–免疫亲和层析–生物亲和层析–金属螯合亲和层析–拟生物亲和层析吸附性质•原理：根据次级键相互作用。•方法：吸附层析变性和复性•原理：蛋白质在一定的理化条件下失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性。当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性。•方法：尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白二、蛋白质的分离纯化细胞破碎蛋白溶解酸、碱醇去垢剂尿素……粗提沉淀相分离分子筛……精提各种色谱电泳分离差速离心……研磨超声渗透压酶……保存预处理（沉淀）原材料的获取浓缩保存状态保存条件保存期限……分离纯化流程纯化•分离纯化流程•预处理（沉淀、粗分离）-纯化（离子交换）机械方法：搅拌、振动研磨压滤超声匀浆非机械方法：干燥渗透压冻融酶细胞破碎体积离子强度pH温度蛋白质的稳定蛋白的溶解蛋白质的粗分离•使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质，这些纯化方法就属于蛋白质的粗分级。•硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀(重点)、透析、超过滤、蛋白质结晶等。蛋白质的纯化•粗分离只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。•常用的实验技术：层析（离子交换等）和电泳1.离子交换层析固相支持物：纤维素、琼脂糖、葡聚糖等高分子聚合物带电基团：羧甲基、二乙基氨基等平衡离子：H+,Na+,Cl-,OH-基本操作过程1.样品制备，装柱与平衡2.上样（样品溶解于A液中）3.洗脱：穿透峰，洗脱峰4.收集、鉴定离子交换层析有两种洗脱方式•分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动相分次洗脱样品蛋白的方法；•梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。•目前随着层析的自动化，梯度洗脱成为大多数情况下的首选方案。2.凝胶过滤层析•利用分子量不同的蛋白质，通过凝胶分子筛时速度不同来分离蛋白质的方法。•常用的凝胶有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、Superdex等。3.亲和层析•以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子的特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。•将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之固定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。各种用于抗体识别的标记His-tag(6-8Histidine)镍离子-6个组蛋白T7-tag(MASMTGGQQMG)HSV-tag(QPELAPEDPED)S-tag(KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag(TTDIEMNRLGK)HA-tag(YPYDVPDYA)Flag-tag(DYKDDDDK)Myc-tag(EQKLISEEDL)1.免疫亲和层析：将蛋白质抗体偶联到免疫亲和柱可用于抗原蛋白的纯化；2.凝集素亲和层析：凝集素是一大类能专一性和糖类和糖复合物结合的蛋白质，固定化凝集素可用于糖蛋白纯化；3.染料亲和层析：有多种染料可与各种类型的酶结合，又不受酶的作用，可用于多种蛋白的分离。亲和层析中的三大通用技术电泳（electrophoresis）•带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象称为电泳。蛋白质在电场中泳动时，受到电场力和摩擦力两种方向相反的力的作用•蛋白质因带电、大小和形状不同而在直流电场中泳动速度不同。常用蛋白质电泳技术•聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）•SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS--PAGE）•等电聚焦电泳（Isoelectricfocusing-IEF）•双向电泳（TwoDimensionalElectrophoresis）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）•凝胶由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（bis）经共聚合而成，此过程在TEMED和过硫酸铵催化下聚合成网状结构的凝胶。•凝胶的孔径可在较宽范围内变化，以迎合不同的分离需要。根据凝胶的均匀性（孔径、pH）可分为连续与不连续两类；根据是否加蛋白质变性剂，可分为变性与非变性两类；根据是否加还原剂2-巯基乙醇或DTT，可分为还原与非还原两类；还可根据电泳装置的不同，分为圆盘电泳和平板电泳。PAGE的分类不连续平板PAGE，是使用最广泛的蛋白质电泳技术，它由浓缩胶与分离胶两部分组成。不连续PAGE有很高的分辨力，因为它有以下三种效应：①浓缩效应②电荷效应③分子筛效应不连续PAGE①染色法：考马斯亮蓝染色法（多种类型可选）、银染法；②活性检测法：适用于NativePAGE，其中蛋白质保持天然活性，可用酶学方法检测；③免疫印迹法：用特异性抗体检测蛋白质的技术。PAGE的检测方法2.等电聚焦电泳•根据蛋白质的等电点进行分离的一种技术。•基本原理：利用两性电解质载体形成一个连续而稳定的线性pH梯度，使pH从正极到负极逐渐增加。蛋白质分子在偏离其等电点的pH位置带电，因此在电场中可以移动；当蛋白质移动到pH等于pI位点，其静电荷为0，在电场中不再移动，据此可将不同pI的蛋白质分离。1.优点①样品加样位置和体积不受限制；②分辨率高于其它类型电泳；③可测定pI值；2.缺点①样品在pI区域易沉淀，为增加样品溶解度，可以在胶中加入尿素，但导致蛋白质失活；②样品前处理麻烦。等电聚焦的优缺点3.双向电泳（概念、原理、作用、用途）•将等电聚焦技术与SDS-PAGE技术组合起来的新技术，是目前分离蛋白质混合物最强大的技术，也是蛋白质组学研究的重要技术。•基本步骤：第一相等电聚焦后，在等电聚焦的垂直的方向进行第二相SDS-PAGE。双向凝胶电泳的原理：第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。应用凝胶中蛋白的检测图像采集和分析蛋白鉴定分离蛋白质组所有蛋白（1）IEF等电聚焦电泳（2）SDS-PAGE（3）染色脱色pH3-----10图像分析在用双向电泳进行差别表达蛋白质组分析时，需要利用软件对产生的2D胶进行差别分析，以寻找差别表达蛋白。常用的软件如安玛西亚公司的ImageMaster2DElite或ImageMaster2DPlanium分析软件。蛋白质的浓缩1.超滤法2.冷冻干燥法3.沉淀法三、蛋白质的鉴定1.蛋白质的含量测定2.蛋白质分子量的测定3.蛋白质免疫印迹技术蛋白质的含量测定•目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品的总蛋白含量；目前没有任何方法能直接分析样品中某一特定蛋白成分的含量；•最常用的蛋白定量方法是凯氏定氮法，LowryFolin法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法等。3.蛋白质分子量的测定SDS-PAGE测定分子量凝胶过滤层析法测定分子量质谱法1.SDS-PAGE测定分子量•基本原理：SDS可以破坏蛋白质中的疏水键和氢键，并按一定比例（1g蛋白质结合1.4gSDS）和蛋白质组成复合物，使蛋白质带的负电荷的量远远超过其本身的电荷量，并与蛋白质的分子量成正比。•2-巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭圆棒形，其轴长与分子量成正比。2.凝胶过滤层析法测定分子量•蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示：lgMr＝K1－K2Ve•在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的Ve，并以它们的lgMr对Ve作图得一直线，再测出样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。SDS-PAGE与凝胶过滤法是互补的•凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量；•SDS-PAGE测得的是蛋白质亚基的分子量；•在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS-PAGE可测得蛋白质每条多肽链的分子量。•综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。质谱法是最精确的分子量测定方法•质谱（MassSpectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱。测定蛋白质分子量的精确度为0.01～0.1％。4.蛋白质免疫印迹技术(重点必须掌握）印迹法的基本原理•印迹（blotting）是生物大分子物质如核酸或蛋白质通过不同途径转移到固相载体上的过程。•与凝胶相比，固相载体容易和各种探针发生化学或免疫学反应。目前常用的印迹法：Southernblot检测DNANorthernblot检测RNAWesternblot检测蛋白质重点蛋白质印迹的用途•用于检测样品中是否有特定蛋白的存在，并进行半定量分析。Westernblotting原理图示原理（问度娘）•WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。基本操作步骤1.样品的制备2.细胞裂解物的SDS-PAGE3.蛋白质的转移4.目的蛋白的检测印迹法最常用的固体材料有硝酸纤维素（NC）膜和PVDF膜。为减少非特异性干扰，需对固相载体进行处理，即用一种与待测物不反应的物质如蛋白质、核酸、吐温20等封闭载体上印迹以外的剩余吸附点（该过程称为封闭），使探针仅与印迹物起反应，且不吸附到载体上。膜种类–硝酸纤维素NC膜–PVDF膜–尼龙膜膜的特点转膜方法重点半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。电转仪转膜后检测丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。探针是用化学方法将能与待研究蛋白质结合的物质如抗体，与某些标示物如酶、同位素或荧光物质、半抗原等结合形成的复合物。蛋白质印迹最常用的探针是酶联抗体（HRP酶或AP酶）。两种常用检测酶系统的比较内参的选择•原因：校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差•种类：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin•化学显色法:方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测•化学发光法:灵敏、快速、节省抗体、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测•同位素法:灵敏度高、不安全、环境污染、半衰期短•荧光底物法：Krypton™荧光底物抗体的选择•单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少价格贵，所以一般来说多抗足够了。一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。大学便民网大学课件下载免疫印迹技术的注意事项•各样品的上样量必须相同•选择合适的胶浓度•充分封闭•驱除气泡•注意保护膜，不能干燥其他常用的蛋白质相关技术•蛋白质纯度