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微生物与基因工程geneticengineeringGeneticengineering基因工程：实现基因克隆所采取方法及相关的工作统称为重组DNA技术或重组DNA工艺学或基因工程一重组DNA技术相关概念Clone:来自同一始祖细胞的相同副本或拷贝的集合；获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)也就是无性繁殖。DNAclone:应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子（复制子replicon），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆，又称为重组DNArecombinantDNA。replicon复制子：在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子。DNAchimeras嵌合DNA：克隆某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子，称为嵌合DNA。二基因工程基本过程1基因的分离或合成：基因文库或cDNA文库分离；化学合成；PCR；定点诱变改造基因2外源基因与载体DNA的体外重组：利用重组DNA技术将外源基因插入质粒、病毒或染色体DNA构建成的载体中含有自主复制起点的“重组DNA分子”3重组DNA导入宿主细胞通过转化、转染或感染等方式将重组DNA导入微生物或动植物细胞中，使其复制，获得克隆4目的基因的筛选与鉴定：获得克隆后进行鉴定和测序5控制外源基因的表达：控制适当条件是导入基因在细胞内表达，产生产品，或使生物体获得性状。获得新性状的微生物称为工程菌，新类型的动植物非别称为工程动物和工程植物或转基因动、植物三微生物与基因工程的关系：1微生物为基因工程提供了及其丰富的基因资源；2基因工程所用的载体主要由质粒、噬菌体和其他病毒DNA改造而成；3基因工程所用的工具酶绝大多数从微生物中分离纯化得到；4微生物细胞是基因克隆的宿主，即使动、植物基因工程也需要构建穿越载体；5微生物是基因表达的生物反应器；6微生物研究能为基因工程提供理论研究第二节基因的分离、合成的定位诱变一从基因文库或cDNA文库中分离目的基因targetgene1从基因文库中分离目的基因：先构建基因组文库后筛选目的基因targetgene有两种类型：cDNA和基因组DNA。genelibrary基因文库：是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。cDNAcomplementaryDNA：指经反转录合成的、与RNA（通常为mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。geneticDNA基因组DNA：指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体及线粒体）的所有DNA序列。（1）genelibrary构建分为五步：1从组织或细胞中提取基因组DNA；2利用限制性酶水解或机械剪切力将其切成适当长度的DNA片段；3选择克隆载体，通常采用λ噬菌体载体或粘粒载体；4基因组DNA片段与载体DNA进行体外连接；5重组DNA直接转化细菌或用体外包装的重组λ噬菌体粒子感染敏感细菌细胞，最后得到基因文库。（2）基因文库中筛选目的基因利用标记基因探针、限制性内切酶、PCR或其他方法从文库中筛选出目的基因。常将克隆菌落或噬菌斑转印到滤膜上再用基因探针与之杂交；若构建基因表达文库，可通过检测基因产物来筛选。2从cDNA文库中分离基因cDNAlibrarycDNA文库：指细胞全部mRNA为模板逆转录成cDNA，与适当载体接合转入受体菌，即获得cDNA文库。mRNA丰度mRNAabundance：指一种特定的mRNA在某个细胞中的平均分子数。低丰度的mRNA需要由公式计算出使其存在概率达99%的最低克隆数目（1）cDNA文库构建A具体方法为五步：1从组织或细胞中提取基因组mRNA；2利用逆转录酶以寡聚（dT）or随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA第一条链；3利用DNApolI以cDNA第一条链为模板，以适当引物合成第二条链。常用RNA酶H在杂交分子的mRNA链上造成切口或缺口，水解留下的RNA片段即可作为引物，或除去杂交分子的mRNA后加入随机引物即可合成第二条链；4cDNA与载体体外连接；5噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cDNA不含基因启动子和内含子，故序列比基因短，克隆载体可用质粒或病毒载体。BcDNA文库的优点：1筛选到目的基因，通常细胞中仅有15%左右基因被表达，故cell中mRNA分子种类数比基因组的基因数小很多，故易表达；2cDNA文库对克隆和表达真核生物基因更重要，因真核生物基因含内含子，在原核细胞不表达，而筛选到的cDNA克隆只要附上原核的调节和控制序列就能在原核细胞表达。（2）从cDNA文库中筛选目的基因方法同从基因文库中筛选二基因化学合成DNA化学合成法科拉纳Khorana1986年获诺贝尔医学奖用于合成基因或基因元件，如1977板仓敬一合成14肽生长激素抑制剂因子的基因；合成核酸探针；合成DNA引物，用于DNA测序，PCR扩增和定位诱变。三PCR扩增基因聚合酶链式反应polymerasechainreactionPCR是一种快速扩增特定DNA序列的技术，1984Mullis1PCR扩增原理：PCR基本反应步骤：1变性，反应体系加热至95℃，使模板DNA完全变性称为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也消除；2退火，将温度下降至适宜温度（一般较Tm低5℃）使引物与模板DNA结合；3延伸，将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。经多次循环（25-30）即可达到扩增DNA片段目的（106-107倍）。2来自微生物的耐高温DNA聚合酶，PCR最初使用Klenow酶，此酶高温易变性后被以下三类替代：（1）TaqDNApol：高温、但缺乏校正功能，萨奇1988水生栖热细菌分离到（2）PfuDNApol和VentDNApol：耐高温、有校正功能，分别来自火球菌和极端耐热细菌。（3）TthDNApol：同时具有逆转录酶活性，可使RT-PCR在同一系统中进行。即使存在极少量RNA（小于100个拷贝）也能逆转录和扩增，可用于研究细胞RNA和RNA病毒。是从嗜热细菌中分离3PCR应用扩增基因和制备DNA探针；定位诱变和DNA测序；传染病检测、遗传病诊断和对癌基因的分析确定；PCR与指纹图谱结合使用可指证嫌犯和个体血缘关系确定。四基因定位诱变site-directedmutagenesis基因定位诱变：按照设计要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换和重组等变异。目前常用定位诱变方法：酶切位点处插入、删除和置换序列、用寡核苷酸知道的诱变和PCR诱变。1寡核苷酸指导的诱变:oligonucleotide-directedmutagenesis的主要步骤：制备单链DNA模板（如M13单链模板）；合成诱变寡核苷酸，其中引入诱变位点；寡核苷酸与模板退火合成异源双链DNA；闭环异源双链DNA分子富集；转染宿主细胞，M13在大肠杆菌中扩增形成噬菌斑；突变体筛选与鉴定（DNA测序鉴定or利用含变异碱基的寡核苷酸探针杂交筛选）2盒式诱变cassettemutagenesis：是一种定点突变技术，将靶基因的一段DNA删掉，并用人工化学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取代，称为盒式诱变。通常做法是：将目的基因变异部位附近找两个限制位点，利用合成的限制性核酸内切酶将二者之间的DNA序列切掉，有一段人工合成的含变异序列的双链DNA取代，从而实现基因定位诱变。3PCR定位诱变已知基因两端和需要变异部位的序列就可用PCR诱变法改造基因序列。故PCR诱变已经成为最常用定位诱变方法。nestedPCR嵌套式PCR：PCR的引物通常在扩增DNA片段的两端，但有时需要诱变的部位在片段中间，这时可在DNA片段中间设置引物，引入变异，然后在变异位点外侧再用引物延伸，此称为嵌套式PCR（1）若变异部位在基因末端，只需引物含有变异碱基即可。（2）变异部位在基因中间，借助重组PCR的方法recombinantPCR进行定位诱变，可在DNA片段任意部位产生定位诱变。需要诱变的位置合成一对含有变异碱基的互补引物，然后分别于5’引物和3’引物进行PCR这样可得到两个PCR产物分别含有变异碱基，由于二者间有一段部分互补重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到变异的PCR产物，还使不同基因片段之间发生重组连接。（对照P273页图）定位诱变技术可用于基因和蛋白结构与功能的研究，进行分子设计改造天然蛋白，通过改变蛋白分子中特异AA序列从而获得有益蛋白突变体。第三节微生物与克隆载体cloningvector克隆载体：将外源DNA代入宿主细胞并进行复制的运载工具，可自主复制，是复制子。对载体的要求是：由自主复制能力，是独立的复制子replicon，含有复制起点；含有多克隆位点，即含有若干限制酶单一切点，便于外源基因插入；携带易于筛选的选择标记；具有一定安全性，在胞内不发生重组与转移，在胞外不能够自由扩散；尽量小，以便于导入细胞进行繁殖，使用安全。目前广泛使用的克隆载体基本上均来自微生物，主要由5类：质粒载体、λ噬菌体载体与黏粒载体、M13噬菌体载体与噬菌质粒载体。一质粒载体1977Bolivar等由天然质粒删除、融合、转座及重排之后构建的克隆载体pBR322，全长4361bp，含tetr和ampr两个抗性基因，为松弛型控制relaxedcontrol。relaxedcontrol松弛型控制：质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如ColE1质粒，这样的控制形式称之为松弛控制型。stringentcontral严谨型控制：严紧型质粒的复制受到严格的控制，每个细胞中的数量只有1～2个，它们似乎与染色体的复制受相同因素的控制，在一定的细胞周期内复制；染色体不复制时，质粒也不复制。含有一个人工构建的多克隆位点multiplecloningsite可随意插入任一位点。pUC系列质粒包括四个组分：pBR322的复制起点；序列经改造的ampr标记基因；乳糖操纵子调节基因lacZ’、启动子和β-半乳糖苷酶α-肽；位于lacZ’靠近5’端的多接头或称多克隆位点MCSIPTG可诱导pUC质粒载体发生α-互补，使X-gal被分解产生蓝色。二λ噬菌体载体与黏粒载体1λ噬菌体载体λ噬菌体大小50Kb左右，约有三分之一对其复制和装配不是必须，故可被替换。DNA两端有黏性末端，由12个核苷酸组成，进入宿主细胞后λDNA两端黏性末端自动结合成环状。λDNA可通过两条途径增殖：裂解途径（lyticpathway）和溶原途径（lysogenticpathway）lyticpathway裂解途径：环状λDNA经多次复制后，才合成病毒蛋白，装配出许多子代病毒粒子，最终导致宿主细胞裂解，释放出许多病毒颗粒。lysogenticpathway溶原途径：λ噬菌体DNA插入到细菌染色体DNA中，随染色体DNA复制而复制，细胞内没有噬菌体颗粒，某些因子可诱导细菌经裂解途径产生噬菌体。λ噬菌体载体可分为插入型（insertion）和置换型（substitution），前者用同一限制酶切开后将外源基因配伍末端与载体两臂相连即可；后者需切除载体一个片段再将外源基因与之置换。λ噬菌体载体最多携带23Kb外源DNA，可100%转化，而质粒DNA转化率只有0.1%。λDNA经滚环复制使单位长度基因组串联成一条长链，称为多连体concatemer，彼此以cos位点连接。噬菌体编码的A蛋白在cos位将λDNA交错切开，进行装配，只要DNA中有cos位点就可以与外壳蛋白进行装配。2黏粒载体层称为柯斯质粒载体含有cos位点可感染大肠杆菌并装配成λ噬菌体颗粒的质粒称为柯斯质粒（cosmid），可携带35-48Kb外源DNA，用于构建基因组文库（genomiclibrary）。黏粒特点：克隆外源DNA能力远超过质粒载体和λ噬菌体载体，可携带35-48Kb外源DNA；在宿主细胞以质粒形式复制，外源基因插入到两个cos位点之间形成重组DNA，并通过体外包