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第十二章微生物的进化、系统发育和分离鉴定地球形成10亿年后开始出现生命,主要是类似简单杆状细菌的原始生物，同期另一些由光合微生物与沉积物形成的片层状化石——叠层石stromatolites也发现较多微生物，其类似绿硫细菌和多细胞丝状绿菌，属于不产氧光合细菌。产氧光合细菌——蓝细菌最早的叠石层在25-30亿年前形成。蓝细菌给地球带来氧气，而后各种真核微生物才开始出现，多样性大大增加。现代生物进化论认为地球上的生命在地球早期特殊环境下形成，通过“前生命的化学进化”过程，由非生命物质产生的。进化evolution：是生物与其生存环境相互作用过程中，其遗传系统随时间发生一系列不可逆的改变，大多数情况下导致生物表型改变和对生存环境的相对适应。研究微生物系统发育phylogeny指的就是研究各种微生物进化的历史。地球上有多少种微生物迄今无准确答案，估计有分类记录的各类物种大约150万，其中微生物大约15万，数目还在不断增加。对微生物分类存在两种基本的、截然不同的分类原则：根据表型特征pheneticcharacteristics相似程度分群归类，这不涉及进化、不以反映生物亲缘关系为目的；按照生物系统发育相关性水平分群归类，目的是探寻各种微生物间进化谱系，建立反映微生物系统发育的分类系统。生物系统学systematics：以进化论为指导思想的分类学，目标在于通过分类追溯系统发育，推断进化谱系，这样的分类学也成为生物系统学。第一节进化的测量指标一进化指标的选择主要是分析比较生物大分子（蛋白、RNA、DNA序列）一级结构特征。研究表明蛋白、RNA、DNA序列进化变化的显著特点是进化速率相对恒定，这些分子序列进化的该变量（AAor核苷酸替换数或替换百分率）与分子进化的时间呈正相关。因此这些生物大分子被看做是分子计时器molecularchronomenters。根据这一原理，可通过比较不同种类生物大分子序列的改变量来确定其彼此间系统发育相关性或进化距离。如果同一种大分子序列差异很大，表明它们进化距离远，这两群生物在进化过程中很早就分支，反之，同一种大分子序列相同，说明它们在同一进化水平上。挑选生物大分子时需注意：1它必须普遍存在于所研究的各种生物类群中，若研究整个生命界的进化，则所选分子应在所有生物中存在，以便于分析比较；2选择在各种生物中功能同源的生物大分子，催化不同反应的酶的AA序列或具有不同功能核酸的核苷酸序列不能进行比较，故大分子进化研究必须从鉴定大分子功能开始；3为鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所选择的分析序列必须能严格的线性排列，以便进行进一步分析比较；4还应注意根据所比较的各类生物之间的进化距离来选择适当分子序列，比较亲缘关系远的生物类群时，必须选择变化速率低的分子序列，因序列进化速率高的分子在其进化进化过程中共同序列已经丧失。功能重要的大分子或者大分子中功能重要的区域，比功能不重要的分子或分子区域进化变化的速率低，即功能大分子或其功能区域的高度保守性。二rRNA作为进化的指征（2011考过）最适合揭示各类生物亲缘关系的5SrRAN和16SrRNA，而16SrRNA应用更为广泛。16SrRNA所以被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”原因：1rRNA参与生物蛋白的合成过程，其功能是任何生物不可缺少的，而且在生物进化漫长历程中其功能保持不变；2在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，故能适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系研究；316SrRNA相对分子质量大小适中，便于序列分析，在5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA3种分子中，5SrRNA约含120个核苷酸，信息量小，应用受限制，23SrRNA相对分子量大（约2900核苷酸）序列测定和分析比较工作量大，使用时难度较大，而16SrRNA相对分子质量大小适中（约1540个核苷酸），含有足以广泛比较各类生物的信息量，并且rRNA在细胞中含量大（约占细胞中RNA的90%）也易于提取；416SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中（真核生物中其同源分子是18SrRNA），故和作为测量各类生物进化的工具。这一点极为重要，20世纪70年代以前生物进化研究没有取得突破性进展的重要原因就是没有找到一把可以测量所有生物进化关系的尺子，这把尺子由美国人伍斯CarlWoese发现，伍斯用这把尺子发现了生命的第三种形式——古细菌。三rRNA的顺序和进化1寡核苷酸编目分析法20世纪80年代中期以前主要采用寡核苷酸编目分析法。序列测定方法：①将纯化的16SrRNA用核糖核苷酸酶（如T1核酸酶）处理，水解成片段，并用同位素体外标记，也可在培养微生物时进行活体标记；②双向电泳层析法分离这些片段，用放射自显影技术确定不同长度的寡核苷酸斑点在电泳图谱中的位置；③根据寡核苷酸在图谱中的位置，小片段寡核苷酸分子序列即可确定。④对于不能确定序列的较大片段核苷酸，还需要把斑点切下，再用不用核糖核酸酶或碱水解进行二级分析或三级分析，直至弄清所有片段序列。⑤在此基础上对6个或更多核苷酸片段按不同长度进行编目，将所有比较的微生物序列目录编好后即可对这些序列目录资料进行分类比较，采用相似性系数SAB值来确定微生物之间的关系。相似性系数法是通过计算相似性系数SAB值来确定微生物之间关系。A和B两菌株的相似性系数SAB=2XNAB/(NA+NB)，其中NAB代表两种菌所含相同寡核苷酸的碱基总数，NA和NB分别代表两菌寡核苷酸所含碱基总数。若SAB等于1，说明所比较两菌株rRNA序列相同，是同一进化时间的微生物；若SAB值小于0.1，两菌亲缘关系很远。序列印记法，则是通过序列比较后若发现某些序列仅为某种（群）微生物所特有的，这些序列可作为该种（群）微生物的印记序列（signaturesequence）。印记序列通常出现在某一特定系统发育的全部成员或绝大多数成员中，故可作为该系统发育群的标志。印记序列对于把微生物归入适当类群，或用来制备核酸探针鉴定微生物有重要意义。伍斯70年代末发现古细菌认为生命应分三界的理论就是采用寡核苷酸编目分析法对大量微生物进行分析比较后提出来的。2全序列分析法20世纪80年代末发展了rRNA全序列分析法，其中最常用的是直接序列分析法，该法用反转录酶和双脱氧序列分析，可对未经纯化的rRNA抽提物进行直接序列测定。具体方法如下：①抽提细胞总rRNA，用少量与16SrRNA分子中某些高度保守的碱基序列互补的DNA寡核苷酸（15-20个核苷酸）作为引物与其混合；②加入反转录酶和32P标记的双脱氧腺苷三磷酸和其他未标记的脱氧核苷酸混合，并分成4等份，往每一份中加入少量4中不同的2,3-双脱氧核苷酸；③反转录酶解读rRNA中的16SrRNA模板，并复制DNA拷贝，通过双脱氧核苷酸类似物的随机结合终止在不同位点上的反转录；④最后用电泳分离所产生的DNA片段（在4个反应体系中，DNA片段结合分别以A、G、C、T结尾）；⑤根据四个反应体系DNA片段在电泳凝胶上的排序，用放射自显影技术解读互补DNA顺序，从而推断出16SrRNA顺序。更新的序列分析技术使用人工合成的与16SrRNA保守区内的序列互补的寡核苷酸作为作为引物，用PCR技术来扩增16SrRNA基因（编码16SrRNA的DNA），再用类似上述方法的双脱氧序列分析法进行直接序列分析。该法所需细胞材料较少，适用于大规模研究。相似性系数或表示距离的数据都是表示存在于两个线性大分子之间的各个位点上碱基相同或不同的数量指征。当把序列的异同资料转化为反应生物之间真实性的进化距离evolutionarydistance时，要考虑到大分子在进化过程中可能发生回复突变或重复置换等所造成的误差，故需要统计学方法对原始数据进行校正，以便反应生物之间亲缘关系。四系统发育树phylogenetictree简称系统树：生物进化和系统分类研究中，常用一种类似树状分支的图型来概括各种生物之间的亲缘关系，这种树状分支图型称为系统发育树。图形中，分支末端和废纸连接点称为结node，代表生物类群；分支末端的结代表仍生存的种类。系统树可能有时间比例或用两个结之间的分支长度变化来表示分子序列的差异数值。系统树分无根树unrootedtree和有根树rootedtree，无根树是简单表示生物类群之间的系统发育关系，并不反应进化途径；有根树不仅反应物种间亲疏还反映出它们共同的起源及进化方向。进行序列测定获得原始资料后，有计算机排序，使各分子序列同源位点一一对应，然后计算相似性或进化距离。计算机分析系统发育相关性构建系统树时，可采用各种方法，常用简约法parsimonyanalysis。这种方法推断谱系的原则是：在所有可能的谱系关系中，设计进化改变的序列特征数最少的谱系是最可信的，故比较过程中要找到比较决定性的序列，这种分析方法基于一种假定：进化的发生是沿着最短的途径、发生最少的变化，从祖先进化成今天比较的生物种类。1981伍斯根据某些生物16SrRNA（或18SrRNA）序列比较，首次提出一个涵盖整个生命界的系统树，而后进行了多次修改和补充。伍斯提出的系统树是有根树，根部代表地球上最先出现的生命，是先有所有生物的共同祖先，生物最初的进化从这里开始。rRNA序列分析表明，进化最先分成两支：一支发展成今天的细菌（真细菌），另一只是古细菌——真核生物分支，该支进一步分叉分别发展成古生菌和真核生物。古生菌和真核生物属“姐妹群”，它们之间的关系比它们与真细菌之间更为密切，某些古生菌（热网菌和热变形菌等）和真细菌中的产液菌分支离根部最近，表明它们可能是现存生物中进化最少的类群。但它们属于现代生物，不属于原始生物。生物间存在着广泛而频繁的水平或横向基因交换，在域内或在域间广泛存在基因水平转移，真核生物有来自细菌或古生菌的基因，两个原核域的生物也有频繁基因交换，甚至一些细菌也获得过真核生物基因。由此，基因的垂直传递不是影响细胞生物进化的唯一过程，横向基因转移也可能深刻影响生物进化过程，故微生物甚至整个生物进化模型看成线性的可能简单了，而是一种网状结构的树。2004Rivera和Lake提出“生命环”ringoflife的观点。五三界生物的主要特征伍斯根据小亚基单位核糖体RNA(SSUrRNA)比较研究，用寡核苷酸序列编目分析法对60多株细菌的16SrRNA序列研究后发现产甲烷细菌完全没有作为细菌的特征序列，于是发现了地球第三种生命形式：古细菌archaebacteria。包括极端嗜盐菌和极端嗜酸热菌都具有不同于细菌和真核生物的序列，于是提出将细胞生物分为三界：古细菌、真细菌Eubacteria、真核生物Eukaryotes。1990年为避免把古细菌看成细菌一类，又把三界（域）改成：细菌、古生菌Archaea和真核生物。并构建了三界生物系统树。古生菌与细菌区别除了16SrRNA序列有差异外，还有如下区别：细胞无胞壁酸；有醚键分支链的质膜；tRNA的T或TψC臂没有胸腺嘧啶；特殊的RNA聚合酶；核糖体的组成和性状不同。全基因组研究也表明古生菌不同于细菌和真核生物。如第一个古生菌詹氏甲烷球菌全基因组序列测定结果显示其只有44%的基因与其他细菌和真核生物同源；该菌在DNA复制、转录和翻译方面的基因类似于真核生物而与细菌差别较大。细菌、古生菌真核生物特征比较特征细菌古生菌真核生物有核仁、核膜的细胞核无无有共价闭合环形DNA有有无复杂内膜细胞器无无有细胞壁含胞壁酸有无无膜脂特征酯键脂、直链脂肪酸醚键酯、支链烃酯键脂、直链脂肪酸tRNA大多有TtRNA的T或TψC臂没有胸腺嘧啶有T启动tRNA携带的AA甲酰甲硫氨酸MetMet多顺反子mRNA有有无mRNA剪接、加帽、加尾无无有核糖体大小70S70S80S延伸因子2与白喉杆菌毒素反应无有有对氯霉素、链霉素、卡那霉素敏感性敏感不敏感不敏感对茴香霉素敏感性不敏感敏感敏感依赖DAN的RNA聚合酶单一类型，4个亚基数种、复杂，8-12个亚基3种、复杂，12-14个亚基聚合酶II型启动子无有有产甲烷种类无有无以叶绿素为基础的光合生物种