沙门氏菌检验

作业指导书文件编号：YCCDC/BZFF06-2016第1页共7页文件名称：沙门氏菌检验方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日沙门氏菌检验1.范围本法适用于食品中沙门氏菌的检验。2.设备和材料处微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1冰箱：2℃～5℃。2.2恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。2.3均质器。2.4振荡器。2.5电子天平：感量0.1g。2.6无菌锥形瓶：容量500mL，250mL。2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。2.8无菌培养皿：直径90mm。2.9无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。2.10无菌毛细管。2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.12全自动微生物生化鉴定系统。3.培养基和试剂3.1缓冲蛋白胨水（BPW）。3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液。3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。3.4亚硫酸铋（BS）琼脂。3.5HE琼脂。3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。3.7沙门氏菌属显色培养基。3.8三糖铁（TSI）琼脂。3.9蛋白胨水、靛基质试剂。3.10尿素琼脂（pH7.2）。3.11氰化钾（KCN）培养基。3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基。3.13糖发酵管。3.14邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG）培养基。3.15半固体琼脂。3.16丙二酸钠培养基。3.17沙门氏菌O和H诊断血清。3.18生化鉴定试剂盒。4.检验程序沙门氏菌检验程序见图1。作业指导书文件编号：YCCDC/BZFF06-2016第2页共7页文件名称：沙门氏菌检验方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日36℃±1℃，18h～24h42℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，40h～48h36℃±1℃，18h～24h图1沙门氏菌检验程序检样25g（mL）样品+225mLBPW1mL+TTB10mL1mL+SC10mLBSXLD（或HE、显色培养基）挑取可疑菌落TSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素（pH7.2），KCN生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+H2S＋靛基质－尿素－KCN－赖氨酸＋H2S＋靛基质－尿素－KCN－赖氨酸＋H2S－靛基质－尿素－KCN－赖氨酸＋/－反应结果与左侧描述不符甘露醇＋、山梨醇＋ONPG－沙门氏菌，血清学实验非沙门氏菌报告作业指导书文件编号：YCCDC/BZFF06-2016第3页共7页文件名称：沙门氏菌检验方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日5.操作步骤5.1前增菌称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2.无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃～5℃不超过18h解冻。5.2增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。5.3分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。与36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD平板、HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂菌落为褐色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可成黑色或棕色；有些菌株成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。5.4生化试验5.4.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可以菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种懒氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和懒氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和懒氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂懒氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属KA＋（－）＋（－）－可疑沙门氏菌属AA＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属AA＋/－＋/－－非沙门氏菌作业指导书文件编号：YCCDC/BZFF06-2016第4页共7页文件名称：沙门氏菌检验方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日KK＋/－＋/－＋/－非沙门氏菌注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性。5.4.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备比必要时复查。表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）懒氨酸脱羧酶A1＋－－－＋A2＋＋－－＋A3－－－－＋/－注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。5.4.2.1反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和懒氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表pH7.2尿素氰化钾（KCN）懒氨酸脱羧酶判定结果－－－甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特征）＋－＋沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：＋表示阳性；－表示阴性。5.4.2.2反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。5.4.2.3反应序号A3：补做ONPG。ONPG隐形为沙门氏菌，同事赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。5.4.2.4必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。表5沙门氏菌属生化群的鉴别项目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ卫矛醇＋＋－－＋－山梨醇＋＋＋＋＋－水杨苷－－－＋－－ONPG－－＋－＋－丙二酸盐－＋＋－－－KCN－－－＋＋－注：＋表示阳性；－表示阴性。5.4.3如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统，可根据5.4.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒作业指导书文件编号：YCCDC/BZFF06-2016第5页共7页文件名称：沙门氏菌检验方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。5.5血清学鉴定5.5.1抗原的准备一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，讲菌株接种在琼脂量较高的（如2%～3%）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55%～0.65%半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%～0.4%半固体琼脂的小试管1次～2次，自远端取菌培养后再检查。5.5.2多价菌体抗原（O）鉴定再玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。5.5.3多价鞭毛抗原（H）鉴定同5.5.2。5.5.4血清学分型（选做项目）5.5.4.1O抗原的鉴定用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。被A～F多价O血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。不被A～F多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：O多价1A，B，C，D，E，F群（并包括6,14群）O多价213,16,17,18,21群O多价328,30,35,38,39群O多价440,41,42,43群O多价544,45,47,48群O多价650,51,52,53群O多价755,56,57,58群O多价859,60,61,62群O多价963,65,66,67群5.5.4.2H抗原的鉴定属于A～F各O群的常见菌型，依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2项的H抗原。表2A～F群常见菌型H抗原表O群第1相第2相作业指导书文件编号：YCCDC/BZFF06-2016第6页共7页文件名称：沙门氏菌检验方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日ABBC1C2D（不产气的）D（产气的）E1E4E4ag,f,si,b,dk,v,r,cb,d,rdg,m,p,qh,vg,s,ti无无25，z152,5无无6，w，x无不常见的菌型，先用8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以第1相和第2相的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下：H多价1a,b,c,d,iH多价2eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51H多价3k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40H多价41,2；1,5；1,6；1,7；z6H多价5z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38H多价6z39,z41,z42,z44H多价7z52,z53,z54,z55H多价8z56,z57,z60,z61,z62每一个H抗原成分的最后确定均应根绝H单因子血清的检查结果，没有H单椅子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出啊第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。位相变异试验方法如下：小玻管法：将半固体管（每管约1mL～2mL）在酒精灯上溶化并冷至50℃，取已知相的H因子血清0.05mL～0.1mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1:200～1:800的量加入。小倒管法：将两端开口的小玻管（下端开口要留一