沙门氏菌的检验

沙门氏菌的检验食品学院14食品质量与安全1班刘文敏柳基炜卫杰恒温紫君201430520115201430520116201430520121201430520122摘要：本实验采用GB/T4789.4-2010的检测方法测定鸡场中的沙门氏菌。通过本实验学习沙门氏菌的检测方法和技术，了解沙门氏菌的一些生化特性；本实验先用显色培养基找出可疑菌落，再做生化试验找出可疑的典型性的沙门氏菌，再通过血清学试验最终确定是否为沙门氏菌属。关键词：沙门氏菌接种生化试验血清学鉴定前言沙门氏菌病是公共卫生学中具有重要意义的人畜共患病种之一，其病原沙门氏菌属于肠道细菌科。沙门氏菌是一个统称，泛指2000多种有紧密连系的细菌，包括引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。虽然只有少数人因沙门氏菌而患病，但是，在世界范围内的细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的占大多数。因此，采用科学、合理的方法检验食品中沙门氏菌，已经成为了人们最关心的问题之一[1]。国标法(GB4789.4-2010)是目前中国规定的食品中沙门氏菌的标准检测方法,也是基层实验室普遍采用的检测方法,它根据沙门氏菌的生长特点和生化特性,采取前增菌、增菌、分离、生化试验和血清学鉴定5个步骤进行[2]。1材料与方法1.1实验材料1.1.1仪器设备均质器、三角烧瓶、平皿、玻璃棒、接种棒恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸头电子天平PL602-S，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂1.1.2试剂药品鸡肠、靛基质试剂、沙门氏菌O和H诊断血清、API20E生化试剂盒或VITEKGNI生化鉴定卡1.1.3培养基蛋白胨水（BPW)、四硫磺酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、尿素琼脂、氰化钾、氰化钾对照、赖氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶对照、甘露醇、山梨醇、β-D半乳糖苷（ONPG）培养基1.2实验方法1.2.1培养基的制备1.2.1.1培养基的配制步骤蛋白胨水（BPW）：称取蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钠1.5g、蒸馏水1000ml，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121℃，15min。分装10瓶，每瓶90ml四硫磺酸钠煌绿（TTB）：高压灭菌121℃，15min灭菌冷却后至30℃，每100ml基础培养液加碘液2ml，煌绿液1ml1.2.1.2配制培养基的注意事项（1)按照说明书上的用量进行换算，称取准确分量的合成培养基粉末；（2）加热煮沸溶解培养基时，留意锅内水位的变化，水位下降可再添加适量的水，以免水分蒸发过多，导致后面分装不够量；（3）往试管中放小导管时，注意处理气泡。1.2.2沙门氏菌群检测1.2.2.1沙门氏菌检测程序2沙门氏菌检测操作步骤2.1前增菌称取10g（mL）样品放入盛有90mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有90mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。2.2増菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL，转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。2.3分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE琼脂平板。于36℃±1℃分别培养18h～24h（HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表12.4生化试验2.4.1三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能，同时也均有不是沙门氏菌属的可能。2.4.2系列生化反应试验接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。2.4.3反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌，如有2项异常为非沙门氏菌。2.4.4反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。2.4.5反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。2.4.6必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。2.5血清学鉴定滴一定生理盐水在载玻片靠近磨砂的一边作对照，在另外一边滴一滴血清，用灭菌后的接种环从三糖铁琼脂培养基的斜面取一点菌种，放进血清中，然后用酒精灯将接种环灭菌冷却后，再取少量菌种放进生理盐水中。观察血清中的的菌落是否凝结，与生理盐水中的菌落对比。2.6结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。3实验结果与分析3.1.1沙门氏菌检测现象和结果（见表7）表7沙门氏菌检测现象和结果试剂硫化氢蛋白胨（加靛基质）尿素氰化钾赖氨酸脱羧酶现象黑色不变色桃红色不浑浊绿色结果+-+-+注：+阳性，-阴性3.1.2实验结果分析对照沙门氏菌生化反应初步鉴定表，尿素，氰化钾，赖氨酸脱羧酸三项中有两项异常，按沙门氏菌生化鉴定表可判定结果为非沙门氏菌属。3.1.3甘露醇和山梨醇试验现象和结果甘露醇和山梨醇都变成黄色，表现为阳性。需要补做血清学鉴定试验。3.1.4OPNG试验现象和结果OPNG变成深黄色，表现为阳性，为非沙门氏菌属。3.2.1血清学鉴定实验现象和结果血清中的菌落没有出现凝结现象，与生理盐水中的菌落现象一样。3.2.2实验结果分析血清学鉴定结果为该菌落为非沙门氏菌属。4实验结论与讨论结论：综合以上生化试验和血清学试验的结果，25g样品中未检出沙门氏菌属。讨论：沙门氏菌是重要的肠道致病菌，肠炎沙门氏菌是其中的一种，常引起鸡、鸭等禽类感染，还可引起食物中毒［5］，但是实验结果显示为非沙门氏菌属，可见实验结果的正确性可信性不高，实验过程中可能存在操作失误（如接种环还未冷却就取种，导致菌种死亡）或者其他原因导致实验偏差，应该重新做实验，严格按照国标再次进行试验，提高实验的准确性和可信度。鉴于鸡肉等畜禽产品污染沙门氏菌所引起食源性疾病的风险，越来越多的学者投入到其生产加工环节的溯源研究中。传统的血清学方法由于存在着抗原的变异及不同种属菌间的交叉反应等，其应用受到了一定限制[3]。而ERIC-PCR技术具有操作简便、重复性强，灵敏度高、鉴别能力强、所需仪器设备简单、成本低等优点，成为细菌基因分型、流行病学调查研究领域里强有力的工具［4］。.5检验报告报告阴性结果：25g样品中未发现沙门氏菌。参考文献[1]陈玲.食品中沙门氏菌检验方法的研究[J].科技与创新，2015,8.[2]孙园园，赵鹏等.沙门氏菌检测方法研究进展[J].中国畜牧兽医，2011，38(1).[3]朱恒文，方艳红等.肉鸡屠宰加工生产链中沙门氏菌的污染调查及ERIC-PCR溯源[J].食品科学，2012，33（17).[4]陈玲，张菊梅等.南方食品中沙门氏菌污染调查及分型[J].微生物学报,2013,53(12).[5]王亮，张元鹏，张荣武，等.鸡源性肠炎沙门氏菌的流行病学调查［J］.中国人兽共患病学报，2011,27(5)．