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1专题5课题1DNA的粗提取与鉴定一、基础知识（一）提取DNA的方法提取生物大分子的基本思路是选用一定的或方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在和性质方面的差异，提取，去除其他成分。（1）DNA的溶解性：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。此外，DNA不溶于溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。（2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解，但是对DNA影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解，但对DNA影响。（二）DNA的鉴定在条件下，DNA遇会被染成色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、实验设计（一）实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑，但是使用的生物组织，成功的可能性更大。（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的，同时用玻璃棒，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的和，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。（三）去除滤液中的杂质方案一利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。方案二直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15min，嫩肉粉中的能够分解蛋白质。方案三将滤液放在℃的恒温水浴箱保温10～15min，注意范围。（四）DNA的析出与鉴定1、将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积、的酒精溶液（体积分数为），静置min，溶液中会出现，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。2、取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的2试剂。混合均匀后，将试管置于中加热5min，待试管后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变。实例：用鸡血细胞液粗提取DNA并鉴定（苏教版必修2）步骤操作图示1、提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液（已在课前配好）5~10mL，注入到50ml烧杯中。向烧杯中加入20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL的烧杯中，取其滤液。2、溶解细胞核内的DNA将物质的量浓度为40mL加入到滤液中，并作玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。3、析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。4、滤取含DNA的粘稠物用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000mL的烧杯中。取纱布上的。5、将DNA的粘稠物再溶解取一个50mL烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为20mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。6、过滤含DNA的氯化钠溶液取一个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液（DNA溶于中）。7、提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入的、体积分数为50mL（加入时动作要慢），并作用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。8、DNA的鉴定取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。三、操作提示31、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g，防止。2、加入洗涤剂后，动作要、，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要，以免加剧，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要，否则会影响鉴定的效果。四、课题成果评价1、是否提取出了DNA观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA，或是实验操作中出现，需要重新制备。2、分析DNA中的杂质本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有、、等杂质。3、不同实验方法的比较对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的、，二苯胺显色的等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。五、课题延伸本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DAN时，通常使用、或等化学试剂。【教材答案】（一）旁栏思考题1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞，再加上搅拌的，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能，有利于DNA的；食盐的主要成分是NaCl，有利于。3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有、和等杂质。5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去；用低盐浓度使DNA析出，能除去。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。6．方案二与方案三的原理有什么不同？4答：方案二是利用分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对耐受性的不同，从而使蛋白质，与DNA分离。（二）讨论题图5-1是DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线，请根据曲线图，思考下面的问题1．在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？答：在NaCl溶液浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最小；当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随着NaCl溶液浓度的升高，DNA的溶解度；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随着NaCl溶液浓度的升高，DNA的溶解度。2．如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？答：根据DNA在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最小的特性，一般先用较高浓度的NaCl溶液使DNA溶解，然后再用蒸馏水稀释至使DNA析出。（三）练习1．答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的、对及的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。2．答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易；并且蛋白质的空间结构，理化性质，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。【知识拓展】1．制备鸡血细胞液时，为什么要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠？答：制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂——柠檬酸钠，。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液便不会凝固。2．鸡血离心或静置沉淀后，为什么要弃出上清液？答：因为上清液是，没有血细胞。DNA主要存在于试管底部的中，所以提取鸡血中的DNA时，要除去血液中的上清液。3．盛放鸡血细胞液的容器最好是塑料容器，为什么？答：鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。4．为什么析出DNA时要用冷却．．的酒精？答：预冷的酒精溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。