畜禽血红蛋白抗氧化肽的制备工艺研究

理学院第四届“创新杯”科技学术论文大赛作品名称：畜禽血红蛋白抗氧化肽的制备工艺研究作品类别：自然科学院系：理学院专业班级：生物技术09-1作者：刘晓丹指导教师：刘莹联系方式：13941890211畜禽血红蛋白抗氧化肽的制备工艺研究刘晓丹，周伟，王伟成，陈尧杰摘要：以畜禽血为原料，用酶解法制备抗氧化肽，并研究[E]/[S]、时间、温度和pH值对实验的影响，实验结果表明鸡血红蛋白抗氧化肽制备的最佳工艺条件为用胃蛋白酶在[E]/[S]为4%、时间3h、温度37℃、pH值为1.5条件下制备的鸡血蛋白抗氧化肽的还原力最强为0.902。关键词：畜禽血；酶解法；抗氧化肽血液经过离心可以分离成血浆和细胞两个部分:血浆约占总量的65%,含8%的蛋白质,用离子交换层析可将其分为三种主要成分,纤维蛋白,各种球蛋白和白蛋白;剩余的约35%的细胞成份主要是红细胞浓缩物,含有36%的蛋白质,主要是血红蛋白。本文主要探索一种实用、高效的畜禽血红蛋白抗氧化肽的制备方法，以提高畜禽血液副产品，并为后续实验研究奠定基础。1材料与方法1.1主要材料：新鲜畜禽血液（鸭血与鸡血为主要成分），购于花园菜市场；胰蛋白酶；胃蛋白酶；中性蛋白酶；其他试剂均为国产分析纯。1.2主要仪器：HH-4型数显恒温水浴锅；TDL-5型台式离心机；B型玻璃仪器气流烘干器；Phs-3C型精密pH计；7230G型可见分光光度计。1.3实验方法1.3.1畜禽血红蛋白的提取新鲜鸡血→抗凝（柠檬酸三钠）→纱布过滤除杂→4℃冷冻离心（3500r/min，15min）→弃上清→破胞（加3倍体积蒸馏水充分搅拌）→冻融（4℃，4h）→4℃冷冻离心（3500r/min，10min）→上清液（鸡血红蛋白溶液）。1.3.2血红蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。1.3.3畜禽血红蛋白抗氧化肽的制备血红蛋白（0.10g/mL）→热变性处理（90℃，20min）→冷却→调pH值→酶水解→灭酶（沸水浴10min）→离心（4800r/min，15min）→取上清→鸡血红蛋白抗氧化肽。1.3.4试验设计正交试验：胃蛋白酶L9(34)列号试验号PH温度（℃）[E]/[S]（%）时间(h)11.5301221.5374431.5447642304652377262441472.5307482.5371692.54442正交试验：胰蛋白酶L9(34)列号试验号PH温度（℃）[E]/[S]（%）时间(h)163012263744364476473046573772674414783074883716984442正交试验：中性蛋白酶L9(34)列号试验号PH温度（℃）[E]/[S]（%）时间（h）18.5451228.5504438.5557649.0454659.0507269.0551479.5457489.5501699.555421.3.5鸡血红蛋白抗氧化肽还原力的测定Yen和SiddhurajuP[1]等人研究表明，抗氧化剂的还原力与其抗氧化性之间存在联系。抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子而清除自由基的，还原力越强，抗氧化性越强。因此，可通过测定还原力来说明抗氧化活性的强弱。在15mL试管中分别加入1mL样品、2.5mL磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/L、pH值为6.6）和5mL1%铁氰化钾，置于50℃水浴中反应20min，然后加入10%的三氯乙酸5mL，摇匀。吸取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL0.1%的三氯化铁溶液，测定样品在700nm处的吸光度值，吸光值越大表明还原力越强[2]。2结果与分析2.13种蛋白酶制备的畜禽血红蛋白抗氧化肽的还原力不同的蛋白酶，由于其水解蛋白质时，作用的位点不同，对蛋白质的水解度不同，制备出来的抗氧化肽的抗氧化活性也会有较大差异。3种不同蛋白酶所制备的鸡血红蛋白抗氧化肽的综合还原力见图1。从图1可以看出，用胃蛋白酶制备的鸡血红蛋白抗氧化肽的还原力最强，所以胃蛋白酶为鸡血红蛋白抗氧化肽制备的最适用酶。3种酶制备的抗氧化肽的还原力00.20.40.60.81胃蛋白酶胰蛋白酶中性蛋白酶用酶的种类吸光度吸光度图12.2正交试验结果分析影响鸡血红蛋白抗氧化肽制备各因素的排列顺序为DBCA，即pH值时间温度[E]/[S][3]；据胃蛋白酶正交实验结果既图2以及各种条件对实验的影响既图3、图4、图5、图6胃蛋白酶正交试验结果00.20.40.60.81123456789试验序列号吸光度吸光度图2得出最佳酶解组合为即[E]/[S]为4.0%、时间为2h、温度为37℃、pH值为1.5，在此条件下制备的鸡血蛋白抗氧化肽的还原力最强，为0.904。PH对抗氧化肽制备的影响00.20.40.60.8111.522.53PH值吸光度吸光度图300.10.20.30.40.50.60.70.80.91234567时间吸光度吸光度图4时间对抗氧化肽制备的影响00.10.20.30.40.50.60.70.80.913134374043温度吸光度吸光度图5温度对抗氧化肽制备的影响00.10.20.30.40.50.60.70.80.911%2%3%4%5%6%7%[E]/[S]吸光度吸光度图6[E]/[S]对抗氧化肽制备的影响3结论畜禽血红蛋白抗氧化肽制备的最佳用酶为胃蛋白酶；最佳酶解条件为时间3h、温度37℃、pH值1.5、[E]/[S]4.0%。抗氧化肽能有效地清除体内过剩的自由基,且能防止脂质过氧化的发生，从而达到保护机体正常运行。以血红蛋白为底物制备的抗氧化肽分子量小、活性强、容易吸收。所以可用于医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等方面，并有广阔的应用前景。随着人们对抗氧化剂作用的认识不断地加深,对抗氧化剂的需求也将会越来越大.以血液为原材料制取抗氧化肽,由于其本身的优越性,并且血红蛋白完全符合作为底物蛋白的条件,所以将必然成为一个应用的新趋势。参考文献：[1]孙骞,胡鑫,罗永康等.猪血红蛋白抗氧化肽的酶法制备及其体外抗氧化活力观察[J].中国农业大学学报,2008,13(4):77-81.[2]裴小平,唐道邦,肖更生,等.抗氧化肽制备的应用现状及趋势[J].食品工业科技,2009,30(2):319-321.[3]牟雪姣,张强,邢静.鸡血红蛋白抗氧化肽的制备工艺研究[J].农产品加工,2009(3):54-56.