瘤胃中高效分解纤维素菌种的筛选研究

瘤胃中高效分解纤维素菌种的筛选研究目录1、瘤胃微生物.................................................................................................................................2瘤胃细菌...................................................................................................................................2瘤胃真菌...................................................................................................................................2瘤胃原虫...................................................................................................................................32、瘤胃微生物产生的纤维素酶及其分布.....................................................................................3瘤胃微生物分泌的纤维素酶...................................................................................................3瘤胃微生物分泌的纤维素酶分布...........................................................................................43、瘤胃微生物纤维素酶的作用机理.............................................................................................44、瘤胃微生物体外培养研究情况.................................................................................................5瘤胃内细菌分离文献：...........................................................................................................5瘤胃内真菌分离文献：...........................................................................................................55、可选择的方案.............................................................................................................................6方案一、直接用瘤胃液（瘤胃内总微生TM）发酵粗饲料..................................................6方案二、从瘤胃内提取高纤维素分解能力的真菌...............................................................66、可能遇到的问题.........................................................................................................................7前言反刍动物的瘤胃是一种独特的消化发酵罐，其中栖息着各种微生物，包括细菌(bacteria)、真菌(mycetes)和原生动物(protozoans)。然而对纤维素降解起主要作用的瘤胃微生物是细菌和真菌，因为它们能分泌降解纤维素的纤维素酶。真菌是分解纤维素的先锋微生物,细菌是其中的优势微生物,原虫的作用则是调节真菌和细菌的种类和数量。早在1882年，Tapperner创立了人工瘤胃技术来研究瘤胃细菌对纤维素的消化作用(施学仕，1983)。20世纪5O年代，Hungate设计出理想的厌氧操作技术，使得严格厌氧的瘤胃微生物得以成功地在体外培养，瘤胃微生物之间的相互作用和影响瘤胃发酵因素的研究成为反刍动物营养研究的重点。（Hungate滚管5.3元/套，价格昂贵）1、瘤胃微生物瘤胃细菌细菌约占瘤胃生物量的50％～80％。并在瘤胃发酵中起着决定性作用。（在瘤胃这个大环境下发挥巨大作用）瘤胃主要的纤维分解细菌有产琥珀酸拟杆菌(Fibrobactersuccinogens)，黄色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)，白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、产琥珀酸拟杆菌（Fibrobactorsuccinogene）和溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrofibrisolvens)。虽然溶纤维丁酸弧菌也能产生纤维素分解酶，但它在半纤维素水解方面的作用更为重要。瘤胃真菌1975年Orpin发现厌氧真菌与细菌共存于瘤胃中，占瘤胃生物量的8％。到了80年代，研究发现瘤胃厌氧真菌对纤维素的降解作用大于细菌。真菌能分泌纤维素酶和木聚糖酶，对粗纤维有明显的消化作用。到目前为止已发现5个属6～7种瘤胃厌氧真菌。包括Neocallimastixpatriciarum、Neocallimastixfrontalis、Piromycescommunis、Sphaeromonascommunis等。在瘤胃微生物中，发现只有真菌具有溶解高抗性纤维如棉花纤维的能力！瘤胃真菌对纤维素的降解包括物理降解(附着作用)和化学降解（酶降解）。许多常用的工业酶制剂只能作用于非晶体状的底物，而瘤胃厌氧真菌产生的酶能降解晶体状的、结构复杂的植物组织，甚至是植物厚壁组织和维管束组织。瘤胃原虫瘤胃原虫分为两个主要亚类，即鞭毛虫和纤毛虫。鞭毛虫出现在饲喂不久的幼龄犊牛，随着犊牛年龄增大，鞭毛虫数量减少。成年反刍动物体内主要的原虫类群是纤毛虫。体内试验研究结果表明，19％～28的纤维素分解酶活是由原虫产生的，但其消化仅局限于一些易受作用的组织，如叶肉细胞(Akin，1989)，大多数贫毛虫具有巨大的纤维素降解活性，去掉原虫就会降低纤维素消化率(Bonho-mme，1990；Yecng等，1993)2、瘤胃微生物产生的纤维素酶及其分布瘤胃微生物分泌的纤维素酶瘤胃纤维素酶是多组分复合酶，主要包含3种酶，即C1、Cχ和β-葡萄糖苷酶。C1酶又称外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶，缩写是CBH,主要作是分解天然的晶体纤维，广泛存在于丝状真菌；Cχ酶又称内切型葡聚糖酶、CMC酶，是水解酶，主作用于可溶性纤维素衍生物，缩写为EG,所有的纤维素分解菌都能产生此酶；β-葡萄糖苷酶，又称纤维二糖苷酶，缩写是BG广泛存在于瘤胃微生物中。瘤胃微生物分泌的纤维素酶分布研究表明：瘤胃微生物产生的酶可分布于RFE(瘤胃液酶)、FAE(附在饲料颗粒上的酶)和CAE(瘤胃微生物菌体上酶)，内源葡聚糖酶和外源葡聚糖酶存在于细胞表面或细胞质中。而β一葡糖苷酶和β一岩藻糖苷酶的糖苷降解酶主要存在于瘤胃液中。这表明瘤胃微生物特别是纤维分解菌与附着在植物细胞壁的菌对纤维质的分解至关重要。根据FAE所含微生物数量及分泌的酶，FAE在瘤胃饲料降解中具有重要作用。Martin认为在瘤胃各部分15N标记微生物生物量中，固体附着微生物(SAM)及其酶活约占瘤胃总微生物量及总酶括的74％。3、瘤胃微生物纤维素酶的作用机理4、瘤胃微生物体外培养研究情况利用细菌、原虫、真菌的纯培养和它们间两种菌的共同培养，研究了它们降解苜蓿草细胞壁的能力，发现在整个降解苜蓿草细胞壁的过程中真菌具有相当高的活性，细菌纯培养在培养后期基本不再降解植物细胞壁，而原虫纯培养根本不能继续降解植物细胞壁物质。瘤胃内细菌分离文献：Isolation,Enumeration,andMaintenanceofRumenAnaerobicFungiinRollTubes1981.12——《APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY》Modifiedbottleplateforthecultivationofstrictanaerobes1992.14——《JournalofMicrobiologicalMethods》2株瘤胃纤维降解细菌的分离鉴定2007.11——《微生物学杂志》牛瘤胃中琥珀酸产生菌的分离鉴定研究2007.10——《合肥工业大学学报》瘤胃内真菌分离文献：厌氧真菌在山羊瘤胃中的分离1999.6——《草食家畜》（季刊）中国黄牛瘤胃厌氧真菌的分离纯化及形态学初步观察1997.28——《畜牧兽医学报》产纤维降解酶厌氧真菌菌株的筛选及其粗酶性质的研究2003.6——南农硕士论文滚管法培养厌氧真菌的技术改进研究2004.2——《动物营养》DFCCS-Ⅱ型双外流连续培养系统与活体牛瘤胃发酵和厌氧真菌培养的比较研究2004.5——内蒙古农大硕士论文瘤胃厌氧真菌的筛选、诱变及发酵麸皮的研究2006.6——四川农大硕士论文5、可选择的方案方案一、直接用瘤胃液（瘤胃内总微生TM）发酵粗饲料参考专利：制作瘤胃饲料的方法及专用设备——1992.6方案二、从瘤胃内提取高纤维素分解能力的真菌真菌的纤维素酶和木聚糖酶活性比瘤胃主导性纤维素分解细菌、原虫和目前工业上常用的产纤维素酶木酶菌等工业用产酶微生物分泌的酶活性都高。Akin等(1990)报道，体外瘤胃真菌可以消化70%的纤维素。瘤胃真菌纤维素分解酶活性比瘤胃主要纤维素分解细菌产生的酶活性高5倍(Lee等1996)。厌氧真菌分泌酶的活性很强、很稳定，另外这些酶可以利用的底物很广泛，并且这些酶都是由胞外分泌，因而在饲料业中将具有广阔的应用前景。滚管法培养厌氧真菌的技术改进研究2004.2——《动物营养》DFCCS-Ⅱ型双外流连续培养系统与活体牛瘤胃发酵和厌氧真菌培养的比较研究2004.5——内蒙古农大硕士论文6、可能遇到的问题1)分离技术、仪器方面的问题。现在从瘤胃中分解细菌和原虫的方法已经比较成熟（差速离心法），但是分解真菌还是比较困难的。分离过程中要用到Hungate滚管、一系列的厌氧设备（厌氧操作台、厌氧培养箱）、人工模拟瘤胃系统和厌氧操作技术等！2)分离出的瘤胃真菌还能不能保持瘤胃中的高纤维素酶活力也是一个值得考虑的问题。