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1高级生物化学作业2008级细胞生物学周文期导师：侯岁稳治疗癌症T细胞疗法改进关键词：免疫治疗，基因疗法，肿瘤免疫学T细胞活体外或者在试管内的激活和抗原特异性的扩大，已经在预防和治疗相关病毒的感染及死后移植方面取得了可喜的疗效和成果。Riddell和他的同事们感染了具有巨细胞病毒特异性的CD8+T细胞克隆注入到造血干细胞移植(HSCT)的接受者的同种基因的异体内，发现注入细胞在人体内是安全的，并能够恢复细胞病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），这在接受者异体骨髓移植中有所体现。但是，这些细胞在缺少CD4+T细胞复原的场所并不活跃，后来，Einsele和他的同事们将多病毒巨细胞病毒特异性的细胞毒性T淋巴细胞注入到八个造血干细胞移植的接受者体内，这些接受者都患有或再次复发巨细胞病毒感染，尽管他们长期使用抗病毒的药物。接下来的T细胞疗法，如同定量聚合酶链反应决定的一样，在患者的评估中表明显著减少。更有趣的是，随着T细胞疗法的时间的推进，这两位病人都具有了强烈的对移植物抗宿主病的免疫抑制。因此，继T细胞疗法在再造巨细胞病毒的免疫力方面是成功的，但是有可能会阻碍患者接受的高剂量免疫抑制。这种继承性免疫疗法的试验在(EBV)病毒相关的移植后淋巴组织增生疾病的预防和治疗方面同样是成功的。Rooney和它的同事已将捐助的多细胞EBV-特殊T细胞系注入到超过60位造血干细胞移植的接受者体内来预防移植后淋巴组织增生疾病。另有六位患者发现淋巴瘤后，注入了病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞。成熟的移植后淋巴组织增生疾病预防组中没有一例病人，相比之下，历史上未经处理的对照组的发病率为11.5%。分析EBV病毒DNA水平注射后看出抗病毒活性的直接证据，在三周内的第一个T细胞输注中，DNA水平就减少了。此外，过继性转让T细胞能够长期坚持和保持对病毒性恢复的抵制。对六例显性淋巴瘤的患者，五年内实现了完全缓解，而对其他病人全面的体外分析表明，注射细胞毒性T淋巴细胞（CTL）后，对病毒缺失突变体的控制得到增强。因此，连续性免疫疗法对免疫系统能力较低的患者预防和治疗病毒相关的疾病时，在其体内是安全、有效、有保护作用的。这些成就促进了本方法在免疫特异性方面治疗肿瘤的扩展运用。最初治疗转移性黑色素瘤患者的方法是注入高度活跃的肿瘤特异性T细胞，没有显示移交细胞被嫁接及持续存在。在EB病毒相关的霍奇金病(HD)和鼻咽癌（NPC）的病例中，注入EB病毒特异性CTL,观察出留在体内，大量通过肿瘤位点，并产生抗肿瘤反应。但是，肿瘤面积较大的患者响应是有限和瞬态的。因此可看出，针对病毒的细胞免疫能力促使免疫系统较弱的患者通过转移体外扩大、抗原特异性T细胞尽可能地改组，而恶性肿瘤中出现的免疫活性还需要更进一步的治疗。许多肿瘤的形成机制已经进化到可以逃避先天性免疫能力和适应性免疫能力。这些包括：a.主要组织相容性复合体（MHC）的调制和功能刺激分子的调制；b.在细胞表面表达Fas配体和其他凋亡分子；c.抑制因子的产生，如转化生长因子和白细胞介素；d.色氨酸臭氧酶，吲哚2，3-双加氧酶的组成性表达；e.调节性T细胞的补充。任何过继性免疫治疗的议定书都必须考虑到这些因素，或者调整T细胞使其有抗免疫规避能力，或者修改肿瘤环境，使其减少对T细胞激活函数和效应函数的抑制。这些评论着眼于针对癌症的过继性T细胞疗法，已经通过一些团体的临床试验来提高其治疗效能。表一T-细胞的遗传修饰2通过基因修复来增强T细胞的功能随着免疫逃避特征描述的上述情况的推论，肿瘤细胞可能存在，甚至可能在存有大量肿瘤特异性T细胞的区域扩散。确实，他们尽管用100gp的多肽移苗诱导体内高水平黑色素瘤特异性T细胞，肿瘤特异性T细胞的频率和疾病进展之间也没有相关性。此外，利用强大的肿瘤反应侵入T细胞就能很容易的从黑色素瘤肿瘤的活检中发现并分离肿瘤，说明这些细胞无力诱导肿瘤回归。这些试验及其他的一些临床试验表明，存在肿瘤特异性T细胞的区域并不能保证一个抗肿瘤效应，也不能通过提高肿瘤特异性T细胞在恶性肿瘤环境下的作用能力来改善临床疗效。随着基因转移技术的发展，如高滴度逆转录病毒系统，现在有可能利用基因修改T细胞，提高他们扩散，存活，和抵抗肿瘤抑制分子的能力，或者改变其受体特异性。在这里，我们讨论新的提高T细胞功能来治疗癌症的遗传特性。T细胞肿瘤特异性的产生过继免疫疗法中，通常是用含有抗原特性的抗原提呈细胞(APC)来反复刺激外周血的单核细胞而生成肿瘤特异性CTL。抗原来源包括：主要组织相容复合限制肽、重组蛋白、肿瘤裂解物、以及遗传学采用的肿瘤抗原基因。同样，已经开始检验一系列能够恢复和扩大抗原特异性T细胞的抗原提呈细胞。APCs如刺激肿瘤特异性T细胞的DCs是备受青睐的。不过，他们数量有限，并且是劳动密集型生产。一些团体已经对抗原提呈细胞（APC）的有用性做了调查，这些APCs包括：T细胞、活性单核细胞、转移性EBV淋巴母细胞系，所有这些抗原提呈细胞表达了刺激和激活分子的高水平，并且能被病毒载体转换以过度特异性抗原，让新一代CTL系具有更突出的反应活性。最近，多媒体技术和IFN-r技术为直接从外周血分离抗原特异性T细胞提供了便利。一旦被分离，这些细胞既可以立即被注入也可以体外扩大。最后，细胞毒性T淋巴细胞被传统性的培养在含白细胞介素2(IL-2)的媒介中支持T细胞存活和体外增值。但是，细胞因子例如IL-6、IL-12、IL-15、IL-21已证明，其对肿瘤特异性T细胞在体外恢复、存活和扩大是至关重要的。过继免疫疗法依赖于确定疾病特征的能力以及从健康捐血者或癌症患者分离肿瘤特异性细胞毒性T细胞的能力。许多疗法还需要大量的体外肿瘤特异性T细胞扩展。此过程的第一步是确定异常表达的肿瘤相关抗原（TAA）或相对正常组织在肿瘤细胞中过度表达的肿瘤抗原。从理论上讲，这些抗原使得肿瘤细胞的具体目标和破坏不会反作用于正常组织。然而，尽管TAAs在肿瘤细胞中异常表达，许多这些蛋白也表达非恶性的成人组织。因此，免疫系统可能认出TAAs属于自我抗原，并能通过正常的容忍机制限制T细胞免疫能力，包括克隆缺失和无反应性。由于具有较高自我亲和力的T细胞在容忍过程中可能被删除，所以分离TAA特异3性T细胞过程可能需要低亲和力的细胞受体，这样杀死肿瘤细胞的效率较低。如果蛋白在正常组织中不能表达，那么源于TAAs决定抗原的T细胞特异性在免疫学上是单纯而稀有的。这些因素限制了一些能从患者外周血分离的TAA特异性T细胞，影响了TAA特异性T细胞在同源抗原刺激下于体外扩展的能力。绕过这些实际的限制，研究人员用能够明确认识TAAs的受体研究获得转基因T细胞。在这里，我们研究两个重定T细胞特殊性的最相近的方法:a.其T细胞受体（TCR）变量a和β链源于高亲和力TAA特异性T细胞克隆的基因修饰；b.插入嵌合抗原受体，通过分离于TAA特异性抗体的单链可变片段（SCFV）来识别肿瘤。TCR基因的转移由于大多数TAA（肿瘤相关抗原）是自我蛋白，所以肿瘤特异性T细胞从癌患者和健康捐赠者的常规分离和扩大被证明是困难的。研究人员从罕有患者的肿瘤反应T细胞中发现带有编码有a和β链的克隆基因，然后将这种克隆基因插入到接受者的T细胞，捐赠给那些具有捐赠者T细胞受体（TCR）特异性的接受者。这个程序允许将一个肿瘤特异性TCR插入到大量的有丝分裂原激活T细胞，使得抗原特异性T细胞快速生产。这一充满希望的方法已经被应用到恶性黑色素抗原、次要组织相容抗原、常见的癌基因。体外实验表明，随着基因转移的推进，引导T细胞获得主体T细胞克隆的抗原特异性，包括针对抗原刺激的IFN-γ生产和裂解肿瘤细胞培养实验。此外，小鼠的研究表明，输入有抗原特异性TCRs的T细胞转移能够消除体外肿瘤。这一激动人心的治疗方法最近已被证明可用来治疗转移性黑色素瘤。在这项研究中，将T细胞转基因注入两位患者，（这种T细胞转基因具有可识别MART-1黑色素瘤抗原的TCR，）并观察CTL的持续存留性和转移灶的客观衰退。尽管临床数据很有价值，但目前治疗TCR基因转移方面仍存在问题，这些问题可能限制基因转移在临床的应用。首先关注的是转移a和β链与内源性TCR链交叉配对，与无意识的自身免疫反应形成混合TCR系，减少了正确配对。这些问题可以通过改变跨膜结合区以消除内源性a和β链二聚化来解决。为了克服基因转移中有高亲和力肿瘤特异性TCRs的同种自体T细胞的缺失，从已被探知的同种异体T细胞克隆高亲和力TCR系。最后，TCR克隆系只认识单一的人类白细胞抗原限制部位，这会限制病人适合以人类白细胞抗原（HLA）为基础的单模型，引导肿瘤通过突变或下调来躲避危险。嵌合抗原受体（CAR）的遗传修复表二嵌合抗原受体另一种修饰T细胞特异性的方法是利用基因编码作用于TAA系的单克隆抗体链。CAR系（也称T机构）由胞内域和胞外域两个区域组成。胞外域负责抗原识别，包含一个通过一个灵活连接结合的单链可变片段（scFv），这个SCFV拥有一个含重型（Vh）和轻型变链(Vl）（重链可变区和轻链可变相互独立）的单克隆抗体。scFv然后与细胞内信号区域连接，这个区域4通常由TCRζ链(CD3-ζ)或IgE高亲和力受体(FcεRIγ)序组成。这种方式可使肿瘤针对非人类白细胞抗原限制，提高患者适应能力。由于T细胞受体只约束来自蛋白抗原的短肽，嵌合抗原受体（CAR）系抗原的扩展范围课识别碳水化合物和糖脂，却不能被常规的TCR系所识别。小鼠模型临床研究表明，T细胞表达CAR系可以消除肿瘤。但是，尽管CARs包含的只有CD3-ζ信号域能过调节肿瘤细胞死亡，它们并不转交增生信号或诱导细胞因子产生，除非通过肿瘤细胞定位提供刺激信号。对于再加活化，T细胞要求有自己的TCR系信号和共刺激分子，只要是CD28分子。由于大多数肿瘤不表达刺激抗原，增加CARs系已被添加到ζ链的细胞内信号域。从CD28列入信号域导致独立刺激细胞因子针对肿瘤刺激分泌和扩散。来自其他刺激分子的信号域，如4-1BB、OX40、ICOS（诱导T细胞共刺激分子），同时通过CAR识别提高T细胞诱导的效应功能。另一种提高CAR表达T细胞在体内存活的方式是确保T细胞借助他们的内源性TCR系在体内被刺激，或者通过疫苗接种，或者通过持久性病毒感染（如CAR表达病毒特异性T细胞）。同样，使用再生CAR的T细胞的问题必须在被广泛采纳应用于临床治疗之前加以解决。首先是可溶性抗原的约束力，如，可溶性CD30或癌胚抗原(CEA)通过恶性细胞或正常细胞分泌，可能会干扰肿瘤认识和/或功能。然而，迄今完成的体外研究表明可溶性抗原并不损害CAR功能。其次，大多数来自小鼠抗体的CAR可能通过大量片段Vh和Vl诱导免疫反应。Lamers和它的同时使用CAIX特异性CAR的报告表明，治疗三例病例运用了基因修饰T细胞成熟的反单链可变片段（scFv）抗原反应。可能必须使用将设CAR系的完全非人类抗体，去克服大量针对基因修饰T细胞的免疫应答。总之，具外源性受体的T细胞遗传修饰能够明确地认识到肿瘤细胞提供了一个强大而又快速的产生肿瘤特异性T细胞的方式。T细胞存活性和持久性有效地T细胞疗法需求注入肿瘤特异性T细胞的体内扩展。这就需要体内抗原刺激，无论是针对肿瘤细胞还是交叉出现肿瘤抗原的专业APC（抗原提呈细胞）系。理想情况下，T细胞注入然后应保留在T细胞记忆室，长期提供对恶性细胞的抵制。大多数肿瘤并不提呈有效抗原和强有力的方法去阻止专业APC系。所以采纳的转移T细胞并不扩展或输入记忆。在一些非病毒生存的临床试验中，肿瘤特异性T细胞和克隆是短命的，T细胞检测到的只有1天，且只有患者注入IL-2时才能检测到。在本节中，我们讨论几个肿瘤特异性T细胞提高持续性和扩散的策略，T细胞遗传修饰和患者环境的处理去创建扩展的空间，并消除抑制细胞类型。效应T细胞与记忆T细胞的比较下面遇到同源抗体和刺激，初始型T细胞分化成细胞毒性潜力增加的效应T细胞，包括穿透细胞膜蛋白质和颗粒酶的水平提高，但是，随着增生潜力下降，表明过继性转让，体外扩展效应记忆性T细胞可能导致较低的存活力和临床效应。实际上，