。白细胞介素-2的研究进展白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)是T淋巴细胞所产生的一类重要的淋巴因子,具有广泛的生物学活性,不仅可以促进T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞的分裂增殖,还可以促进其它细胞因子如干扰素等的分泌,增强抗原提呈作用,是调节机体免疫的重要细胞因子,在抗肿瘤、抗毒素及感染性疾病的治疗中也具有重要用自白细胞介素-2发现以来,许多学者对其展开研究,对白细胞介素-2的结构、分泌、调节、种属特异性、生物学活性、受体等方面有了较深的认识,本文就白细胞介素-2的研究进展作一综述IL-2的发现及命名当时分别称之为“淋巴细胞丝裂原因子”(lymphocytemitogenicfactor)、“致母细胞性因子”(blastogenicfactor)、“T细胞激活因子”(Tcellactivatingfactor)。1976年,Morgan等发现,将T细胞上世纪60年代,一些学者发现多种来源于植物的外源凝集素(lectin)可在体外刺激淋巴细胞转化及增殖。这些外源凝集素如植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA),刀豆蛋白A(ConcanavalinA,ConA)对淋巴细胞起着有丝分裂原的作用。在丝裂原刺激的淋巴细胞培养上清中具有可溶性丝裂原因子1丝裂原(PHA)刺激的人外周血淋巴细胞培养上清加入体外培养的人白血病细胞或骨髓细胞之后,该上清可导致上述细胞的体外增殖,作者当时将种上清称为“条件培养基”(conditionmedium,CM)。表型分析及功能测定均证实,CM诱导生长的细胞为正常T细胞群体。Gills和Smith3等利用ConA刺激的大鼠及小鼠CM先后在体外建立了小鼠细胞毒性T细胞(CytotoxicTLymphocyte,CTL)和辅助性T细胞(helpTcell,Th)克隆。这些传代培养的T细胞克隆株的生长严格依赖于CM,去除CM后传代的T细胞迅速死亡。很显然,能够促进效应性T细胞体外增殖的关键因素是存在于CM中的某些活性分子,当时根据生物活性将其命名为T细胞生长因子(Tcellgrowthfactor,TCGF)。1979年第二届国际淋巴因子会议将TCGF命名为白细胞介素-2(IL-2)。IL-2的发现,为体外长期培养T细胞克隆提供了方便,也揭开了细胞因子网络研究的序幕。52.IL-2的理化特性和生物学活性通过DEAE-Sephacel离子交换层析,SephadexG-100分子筛过滤,制备性等电聚焦(IEF)和聚丙烯酰胺凝胶电泳等生化提取手段,已分离纯化了多种种属IL-2。1979犬白细胞介素-2基因的克隆、表达及表达产物的复性研究年,Wastson[4]等首次纯化了小鼠的IL-2,凝胶分析后认为,小鼠IL-2的分子量为30KD,等电聚焦后形成两条带,等电点(pI)分别为4.3和4.9。此后,大鼠、人、长臂猿、豚鼠、兔、猪、绵羊、牛以及鸡等的IL-2相继被证实,他们的一些特点见表1,表2[5,6]。IL-2的主要靶细胞是T淋巴细胞,同时也具有下列生物学活性:(1)促进T细胞生长及克隆性扩增;(2)诱导或增强细胞毒性细胞(如NK、LAK、TIL)的杀伤活性;(3)协同刺激B细胞增殖及分泌;(4)增强活化的T细胞产生IFN和CSF;(5)诱导淋巴细胞表达IL-2R。年,Wastson[4]等首次纯化了小鼠的IL-2,凝胶分析后认为,小鼠IL-2的分子量为30KD,等电聚焦后形成两条带,等电点(pI)分别为4.3和4.9。此后,大鼠、人、长臂猿、豚鼠、兔、猪、绵羊、牛以及鸡等的IL-2相继被证实,他们的一些特点见表1,表2[5,6]。IL-2的主要靶细胞是T淋巴细胞,同时也具有下列生物学活性:(1)促进T细胞生长及克隆性扩增;(2)诱导或增强细胞毒性细胞(如NK、LAK、TIL)的杀伤活性;(3)协同刺激B细胞增殖及分泌;(4)增强活化的T细胞产生IFN和CSF;(5)诱导淋巴细胞表达IL-2R。表1天然IL-2的理化特性3.IL-2的结构与功能蛋白质的结构(包括一级结构和空间结构)与功能密切相关。近年来,借助基因工程、蛋白质工程技术,已可在基因水平对IL-2进行定向改造,并制造出多种变异的IL-2分子,为分析IL-2的结构功能关系铺平了道路。同时利用X线衍射对IL-2进行蛋白质晶体分析,并结合电子计算机技术设计出了IL-2三维结构模型,也为进一步阐明IL-2空间结构及IL-2与IL-2受体相互作用的机制奠定了基础。人IL-2由133个氨基酸组成,其分子中有3个半胱氨酸(Cys),分别位于第58、105和125位,第58与105位Cys之间形成一个二硫键[7]。IL-2的二级结构主要由6个α-螺旋区组成,分别为螺旋A(11~19)、螺旋B(33~56)(中间被47Pro隔断,分为B,B’),螺旋区C(66~78),螺旋区D(83~101),螺旋区E(107~113)和螺旋区F(117~133)。成熟的IL-2分子,6个螺旋区折叠,N端与中区靠近,螺旋区B、C、D、F形成一个反向平行的α-螺旋束[8、9]。近年来,利用基因定位突变法改变IL-2中氨基酸的顺序,观察突变体的活性、空间结构及与受体结合能力的变化,获得许多IL-2结构与功能的相关信息。国内外许多学者进行了相关的研究。就IL-2分子整体而言,其天然构型的稳定性对其功能有非常重要的作用。IL-2靠58位和105位的Cys间形成二硫键维持其空间结构。Wang等[7]用特异位点诱变法修饰了IL-2基因上编码Cys的密码子,使之编码丝氨酸(Ser)或丙氨酸(Ala),得到了Ser58-IL-2、Ser105-IL-2及Ser125-IL-2变异分子。这一突变导致了IL-2一级结构的微小改变,一个氧原子代替了硫原子,防止突变位点上形成二硫键。SDS-PAGE分析证实,各种IL-2的分子量仍为15KD,但生物学活性却有显著差别。Cys58和Cys105被Ser替代后,IL-2的活性几乎完全消失[10],说明58位的Cys和105位Cys间的二硫键对维持IL-2的活性构像是必需的。Wang等[7]发现Ser58突变型IL-2活性低于Ser105-IL-2,这提示58位的Cys除参与二硫键外,可能还有其它作用,推测可能与结合IL-2受体有关。而当用Ser(或Ala)替代Cys125时,IL-2活性明显提高[10],这说明125位的Cys不参与二硫键的形成,也不参与受体结合。对于基因工程重组IL-2来说,125位的Cys的存在会引起分子内二硫键的错配,或分子间二聚体的形成,这虽不直接影响IL-2与受体的结合,但破坏了IL-2分子的天然构型,从而影响IL-2的活性,若将其改成Ser或Ala,就排除了Cys125与Cys58或Cys105之间形成错配二硫键的可能性,从而提高了IL-2的活性。Fukuhara[11]用质谱技术分析了Turkat细胞分泌的IL-2和基因工程产生的重组IL-2的氨基酸顺序也证实了上述结论。于忠国等[12]应用PCR和定点突变技术将编码125位的Cys的密码子突变成编码丙氨酸(Ala)的密码子,将此突变基因受控于PRPL串连启动子和人工合成SD序列,在E.coli中获得高效表达,用凝胶过滤法分离表达产物获得新型白细胞介素2,其比活性达1×107IU/mg蛋白。在IL-2空间结构中,不同的α螺旋区结构变化对其功能有不同影响。螺旋A的存在是IL-2活性所必需的[9、13]。α螺旋B区中当30~49位氨基酸缺失时,IL-2活性急剧下降[13、14]。α螺旋E是IL-2与IL-2受体α亚基的结合部位,而与IL-2的活性毫无关系。α螺旋A、B、F均为两亲性螺旋,其疏水面相互靠近成为一疏水核,是一重要的结构域,可能与IL-2与β亚基的结合有关,这三个α螺旋的稳定性及某些氨基酸如17Leu、20Asp、42Phe、44Phe、45Tyr、56Leu、121Trp的侧链基团的极性和空间位置对活性有重要影响[10]。4.IL-2的基因结构与表达调控自1983年Taniquchi[15]等首次克隆了IL-2的cDNA后,人们对IL-2的基因结构、表达调控进行了深入的研究。1984年,Mita、Fujita[9、16]等从人类基因组文库中分离了人IL-2的基因组基因,分析了人IL-2基因结构并确定其核苷酸序列和侧翼序列。IL-2基因由4个外显子和3个内含子组成。外显子1含5’端不翻译区并且编码IL-2起始的49个氨基酸,其中前20个氨基酸为信号肽,在IL-2成熟时被水解掉。91bp的间隔区(内含子)后是编码20个氨基酸的外显子2,随后是2292bp的长间隔顺序,其中含有与病毒增强子核心序列相似的核苷酸序列,有人认为这些序列对活化T细胞IL-2基因的表达可能有一定作用。外显子3编码接续的48个氨基酸,接下去的第三内含子长1346bp。第4外显子编码余下的36个氨基酸。PolyA信号在终止密码后的261个核苷酸处。小鼠IL-2基因基本组成与人类相似[9、17、18],内含子区极少有同源部位,但在外显子区,二种基因的核苷酸顺序有72%一致,在5’-侧区的500bp中85%同源。这种高度同源现象也提示这一区域可能参与控制激活T细胞IL-2基因的表达。它们的结构特征与其它诸如IL-4、GM-CSF等一些细胞因子的基因结构类似,这一特征提示,这类细胞因子也许是由一个共同的基因进化而来[19]。休止淋巴细胞不表达IL-2基因,只有经外源抗原或丝裂原刺激后IL-2基因才活化。T细胞丝裂原PHA和ConA等可诱导T细胞表达IL-2mRNA,而B细胞丝裂原LPS(脂质体)、MDP(胞壁酰二肽)等则无此作用,表明IL-2基因活化是受特定因素调节的。较多的实验证明,人静止或活化T细胞的基因组以及分泌或不分泌IL-2细胞系的基因组都只含一个IL-2的拷贝[20],所以除有等位基因的差异外,人IL-2的不均一性均由翻译后修饰所致[21]。IL-2分泌水平和细胞内mRNA的水平密切相关,这一现象提示,IL-2的表达调控很可能是由体内mRNA的转录水平所控制。Elliott等[22]报导环孢素A(CSA)阻断IL-2的产生是由于其抑制IL-2mRNA转录及其去稳定作用选择性抑制了细胞内IL-2mRNA的积聚所致,初步证实了表达调控主要在转录水平。6.IL-2受体(IL-2R)在早期的研究中[2、3、40],人们注意到T细胞必须经抗原或有丝分裂原的刺激才能对IL-2起反应,这提示人们,外界刺激可使T细胞发生某种形式的变化或产生某种新的成分对IL-2起反应。1981年,Robb[41]等发现T细胞表面存在IL-2受体(IL-2receptor,IL-2R),IL-2必须和受体结合后方能发挥作用。1982~1983年,Leonard[42]等和Smith[43]等分别建立了IL-2R和IL-2单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)。Doreen[44]等用IL-2RmcAb对IL-2R的动态变化进行了研究,发现T细胞受到有丝分裂原等刺激后IL-2R即在其表面积累。至此,开创了IL-2R及IL-2功能研究的新局面。IL-2发挥其生物学作用是通过与免疫细胞表达的特异性IL-2R结合,传导IL-2信号而实现的。T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)、淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)及单核巨噬细胞表面都存在不同数量的IL-2R[45]。抗原或丝裂原刺激T细胞产生IL-2,同时表达IL-2R。此时T细胞转变为IL-2应答细胞。IL-2与受体结合诱导T细胞产生一系列反应,包括细胞增殖、分化,产生其他一些淋巴因子等。事实上IL-2/IL-2R结合诱导的细胞增殖反应是整个免疫应答过程中的关键[46]。随着重组DNA技术在免疫学中的深入应用,IL-2R的研究不断获得新的突破:1987年Mitchell等发现激活后的T细胞表面出现一种能与IL-2结合的抗原成分并称之为Tac抗原[47、48];1989年,Hatakeyama等首先分离到了IL-2Rβ的基因[