皮肤创伤愈合过程中TGFβ1mRNA表达与损伤时间关系的实验研究[J]

精品文档皮肤创伤愈合过程中TGF-β1mRNA表达与损伤时间关系的实验研究作者：李学锋1；王慧君1；罗红2(1南方医科大学南方医院病理科，广东广州510515；2中山大学，广东广州510215)摘要：目的研究TGF-β1mRNA在皮肤创伤愈合中的表达变化规律及其在损伤时间推断中的价值。方法用实时PCR技术检测不同造创时间(生前伤15min~2周，死后伤1~6h)小鼠皮肤切创创缘组织TGF-β1mRNA含量，并同时检测GAPDH含量对结果进行均一化。结果TGF-β1mRNA于伤后24h显着增高(和对照组比较P0.01)，48h和72h时还保持在较高水平。死后伤1h和3h时，TGF-β1mRNA的表达有增高的趋势，6h则降至对照水平。结论TGF-β1mRNA在小鼠皮肤创伤后有明显的规律性表达，能作为一种代表性细胞因子参与有一定存活时间(6h以上)的生前伤损伤时间的推断。实时PCR技术能对mRNA的表达水平进行较为精确的检测，是目前损伤时间推断研究中用于细胞因子定性和定量研究的有效方法。关键词：TGF-β1；创伤修复；损伤时间推断；实时PCR中图分类号：R338文献标识码：A文章编号：1673-4254(2006)01-0059-03Temporalrelationoftransforminggrowthfactor-β1mRNAexpressionwithinjuryinthehealingprocessofmouseskinwoundsLIXue-feng1；WANGHui-jun1；LUOHong21DepartmentofPathology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2SunYat-senUniversity,Guangzhou510215,China精品文档Abstract:ObjectiveToexplorethetime-relatedexpressionoftransforminggrowthfactor(TGF)-β1mRNAinthehealingprocessofmouseskinwoundsanditspotentialapplicationinforensicwoundageestimation.MethodsReal-timePCRwasusedtoquantifyTGF-β1mRNAexpressioninmouseskinwoundsinducedatdifferenttimepoints(15minto2weeksbeforeand1to6hafterdeath).TheexpressionofGAPDHwasalsodetectedfornormalizationofTGF-β1mRNAlevel.ResultsTGF-β1mRNAintheantemortemwoundswaselevatedsignificantly24haftertheinjury(P0.01byDunnettest)andmaintainedthehighlevelat48and72h.Inpostmortemwounds,TGF-β1mRNAtendedtoincrease1and3hafterinjury,anddecreasedtothecontrollevelat6h.ConclusionsTheexpressionofTGF-β1mRNAiscloselyrelatedtothetimeofwoundandcanthereforebeusedasarepresentativecytokinemarkerfordatingtheskinwoundsinducedover6hbeforedeath.Real-timePCRfordetectingdynamicexpressionofTGF-β1mRNAinwoundhealingprocessprovidesareliablemeansforqualitativeandquantitativecytokineanalysisforforensicwoundageestimation.Keywords:transforminggrowthfactor-β1;woundhealing;woundageestimation;real-timePCR收稿日期：2005-03-24基金项目：国家自然科学基金(39870764)SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(39870764)作者简介：李学锋(1974-)，男，博士研究生通讯作者：王慧君，电话:[phone],E-mail:[e-mail]精品文档创伤修复是一个在时间和空间上受修复因子调控的复杂生物学过程，多种生物活性物质在创伤修复的不同阶段发挥着重要的调节作用，同时它们在创伤修复中的表达和损伤时间密切相关。其中细胞因子在创伤修复中的活跃表达，使其作为活体伤中一种分子水平的“生活反应”迹象，成为推断损伤时间新的参考参数。多种细胞因子在动物皮肤创伤修复过程中均有规律性表达，其中部分因子的表达在人体标本上得到印证[1][2][3][4][5][6]。我们以前的研究发现，TGF-β1是与损伤时间关系较为清楚的一种细胞因子，它很可能作为一种标志性的因子，用于精确推断损伤时间[7][8]，但鉴于斑点杂交和RT-PCR等技术在核酸定量上的不足，认为有必要应用实时PCR技术，深入调查和精确阐明TGF-β1mRNA在创伤修复过程中的表达变化规律，进一步验证和完善TGF-β1mRNA的表达在损伤时间推断中的研究。实时PCR技术在理论上能较好地解决核酸的定量问题，已被认为是细胞因子定量有效和稳定的方法，但在损伤时间推断的应用方面，国外文献报道较少，国内未见报道。1材料和方法1.1实验动物的分组、造创和组织处理清洁级昆明小鼠，雌雄不拘，6~7周龄，购自南方医科大学实验动物中心。随机分为实验组和对照组，实验组按生前不同造创时间分为12组(伤后15min，30min，1h，3h，6h，12h，24h，48h，72h，96h，1周，2周)，每组3只动物。动物于造创前1d用8%硫化钠背部脱毛，乙醚吸入麻醉，局部碘伏消毒，用无菌手术刀片于背部脊柱两侧皮肤各作一切口，长约1.5cm，深达肌肉筋膜。动物造创后入清洁笼内饲养，给清洁饮水，自由取食。于造创后相应时点颈椎脱臼处死动物，取创口及周围0.5cm全层皮肤及皮下组织。对照组动物不造创，处死后取相应部位皮肤及皮下组织。另设死后伤组，于动物处死后1、3、6h造创，造创后30min精品文档取材，每组3只动物。皮肤组织离体后，立即置液氮保存待检。1.2引物和Taqman探针的设计、合成小鼠TGF-β1和GAPDH特异性引物和Taqman探针用PE公司的PrimerExpress2.0软件设计，上海生工公司合成。序列如下：TGF-β1:上游引物:5'-TCGACATGGAGCTGGTgAAA-3'下游引物:5'-GAGCCTTAGTTTGGACAGGATCTG-3'Taqman探针:5'-AAGCGCATCGAAGCCATCCGTG-3'GAPDH:上游引物:5'-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3'下游引物:5'-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3'Taqman探针:5'-TCGTGGATCTGACGTGCCGCC-3'1.3皮肤组织总RNA的提取用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[9]抽提总RNA，操作过程中严防RNA酶污染。1.4逆转录反应反应体系为：5×逆转录缓冲液4μl，MMLV-RT(10U/μl)2μl，dNTP(10mM)0.4μl，下游引物0.4μl，总RNA5μl，DEPC水7.8μl；反应条件：37℃1h，95℃3min灭活逆转录酶。TGF-β1和GAPDH逆转录的反应体系和条件相同，但加入的为各自的下游引物。1.5TGF-β1和GAPDH目的片段的克隆按以下反应体系分别扩增TGF-β1和GAPDH目的片段：5×buffer10μl，dNTP(10mmol/L)1μl，Taq酶(3U/μl)1μl，Forwardprimer1μl，Reverseprimer1μl，cDNA5μl，ddH2O31μl，反应条件为：93℃2min，93℃1min，55℃1min，72℃1min，40个循环，72℃10min。产物经3%琼脂糖凝胶电泳证明无杂带。取约250μl产物用WizardSVGelandPCRClean-UpSystemPCR纯化试剂盒(Promega)纯化，纯化产物连接入PGEM-T载体(Promega)，转化DH5α菌，挑选阳性菌落用PCR扩增目的片段进行初筛，选PCR阳性菌落进一步进行序列测定验证目的片段，并提取制备质粒。精品文档1.6实时PCR根据质粒提取液的D260值换算分子拷贝数(copy/μl)，并作梯度稀释，作为阳性标准品，用于标准曲线的生成。质粒标准品和待检样品cDNA均按以下体系进行反应：5×定量缓冲液10μl，Taq酶(3U/μl)1μl，dNTP(10mmol/L)1μl，Forwardprimer1μl，Reverseprimer1μl，TaqmanProbe1μl，cDNA5μl，ddH2O30μl，反应条件：93℃2min，93℃1min，55℃45s，40个循环。以灭菌ddH2O代替模板作为阴性对照。使用试剂为ABI荧光定量试剂盒，购自华美公司，仪器为PE7000全自动荧光定量PCR仪(PerkinElmer)。1.7结果的统计学处理计算同一样品目的基因(TGF-β1)和参照基因(GAPDH)拷贝数的比值，代表TGF-β1mRNA的表达水平，结果以各组比值的均数±标准差表示。用Dunnet检验进行统计学分析。2结果TGF-β1mRNA在包括对照组和死后伤组在内的各时点的组织中均有表达。样品TGF-β1的拷贝数用GAPDH的拷贝数均一化，结果示在伤后24h显着增高(和对照组比较P0.01)，48h和72h时还保持在较高水平。死后伤1h，3h时，TGF-β1mRNA的表达有增高的趋势，6h则降至对照水平(图1)。3%琼脂糖凝胶电泳显示，PCR产物片段长度和预期相符，除目的条带外，无杂带。精品文档图1伤后不同时间TGF-β1mRNA表达Fig.1ExpressionofTGF-β1mRNAatdifferenttimepointsafterinjury*P0.01vscontrolgroup3讨论TGF-β1mRNA表达的实时PCR检测显示，TGF-β1mRNA在伤后6h以前均未见明显增高，伤后6~12h有上升趋势，至24h达到峰值，并持续至伤后72h。TGF-β1表达的免疫组化检测证明，在创伤修复早期，TGF-β1主要在表皮表达，后期则主要在炎性细胞和修复细胞中表达。一般认为，mRNA先于相应蛋白的表达，而TGF-β1mRNA的表达峰值于伤后24h出现，说明TGF-β1在创伤早期表皮的表达比重不高，主要大量表达于后期的巨噬细胞和成纤维细胞等炎性细胞和修复细胞。这种表达规律和TGF-β1在创伤修复中的作用是相吻合的。于动物死后1h，3h造创后，创缘组织TGF-β1mRNA含量和对照组比较有增高的趋势，直至6h才降至对照组水平，这与斑点杂交和免疫组化的结果类似[7]。认为死后伤细胞因子增高的原因是：⑴死后短期精品文档内，动物作为整体已经死亡，但局部的组织细胞对缺血缺氧有一定的耐受力，还具有超生反应能力，在局部切割的机械刺激下，还能释放甚至合成生物活性物质[9][10][11]，而此时细胞因子之间相互作用的抑制机制可能已经消失，从而导致相应时点的死后伤表达高于生前伤；⑵死后造创时，伤口部位由于局部血管破裂导致血液从血管流出，进入组织间隙，血液中存在的细胞因子也可能造成检测结果的升高。因此，对死后伤与生前伤的鉴别而言，单凭TGF-β1m