洪俊-微量凯氏定氮实验

总氮量的测定——微量凯氏定氮法一、目的与要求1、学习微量凯氏定氮法的原理。2、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准硫酸铵含氮量的测定、未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。二、实验原理天然有机物（如蛋白质、核酸及氨基酸等）的含氮量常用凯氏定氮法来测定。当被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜与及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。消化完了后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氮蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定，准确测定氨量，从而折算出含氮量。以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下:1.NH2-CH2-COOH＋3H2S04→2C02＋3S02＋4H20+NH32.2NH3+H2S04→（NH4）2SO43.（NH4）2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4＋2NH3↑测定时常用硼酸溶液收集氨，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后再用强酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。所用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。本法适用的范围为0.2-1.0毫克氮。相对误差应小于±2％。三、试剂和器材1、试剂(1)浓硫酸(化学纯)(2)30%氢氧化钠(分析纯)溶液(3)2%硼酸溶液。(4)0.0106N标准盐酸溶液。(5)粉末硫酸钾-硫酸铜混合物(K2SO4:CuSO4·5H2O=3:1或80gK2SO4,20gCuSO4·5H2O及0.34g硒酸钠)粉末,充分研细混匀。(6)指示剂混合液：取50ml0.1%甲烯兰-无水乙醇溶液与200ml0.1%甲基红-无水乙醇溶液混合，贮于棕色瓶中备用。本指示剂在pH5.2时为紫红色，在pH5.4为暗蓝(或灰色)，在pH5.6为绿色。变色点PI=5.4，所以指示剂的变色范围很窄pH5.2-pH5.6，极其灵敏。（7）硼酸-指示剂混合液（8）标准硫酸铵溶液（0.3mg/ml）（9）30%双氧水或者高氯酸2、器材(1)凯氏烧瓶(2)表面皿。(3)消化架(4)吸量管(1ml、2ml)(5)滴管(6)量筒(10ml)(7)凯氏定氮蒸馏装置(8)微量滴定管(5ml，可读至0.02ml)(9)锥形瓶(50ml)(10)容量瓶3、测定样品：血清、鸡蛋清、牛奶或其他样品四、操作方法1、样品处理血清样品：取人血或（猪血），放于离心管中，于冰箱中放置过夜，次日离心除去血凝块，上层黄色透明清液，即为血清。吸出1ml血清，加到50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，混匀备用。溶液如显浑浊，加少量氯化钠，再混匀。固体样品：测定某一固体样品中的含氮量，都是按100克该物质的的干重所含的氮克数来表示（%）。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除掉。操作时先将样品磨细，在已称量瓶中称入一定量的样品，再置于105℃的烘箱内烘烤1小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重。按上述操作，每烘干1小时后重复称量一次，直至两次称量数值不变，即达到恒重为止。2、消化准备4个50ml的凯氏烧瓶，并标号，向第1、2、3号烧杯内各加入2ml样品溶液，再加入3-5个玻璃珠，防止暴沸。注意，用吸量管直接将溶液（或用试管加入固体样品）加至烧瓶底部，切勿沾于瓶品及瓶颈上。向4号烧瓶加入2ml水，其它操作同样品管，作为空白对照。在每个烧瓶中加入约200mg硫酸钾-硫酸铜混合物，再用移液管加入浓硫酸3ml，混匀，将以上4个烧瓶放到消化架上，置于通风橱内进行消化，先用小火焰加热煮沸，首先看到烧瓶内物质碳化变黑，并产生大量泡沫，此时要特别注意，不能让黑色物质上升到烧瓶颈部，否则将严重地影响样品的测定结果。当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时，将火焰调节到使瓶内液体微微沸腾。假如在瓶颈上发现有黑色颗粒，应小心地将烧瓶倾斜振摇，用消化液体将它冲洗下来，在消化中要时常转动烧瓶，使全部样品都侵泡在硫酸内，以便在微沸的硫酸含中不断消化，消化液在轻度迥流的状况下大约维持6~8小时（对于那些赖氨酸含量较高的蛋白质样品甚至需要12小时）。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30%过氧化氢溶液1~2滴，加到瓶底消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色，消化即告完成（固体样品约需7小时）。为了保证反应的彻底完成，再继续加热消化1小时。消化完结，关闭电源，使烧瓶冷却室温。后定容至100毫升。3、蒸馏（1）仪器的洗涤仪器洗净的标准：用硼酸-指示剂混合液于冷凝管下口接受蒸汽时，若1~2min后溶液未变成鲜绿色，而只变成灰色或暗绿色，即可认为基本上未变色仪器已洗净。凯氏微量定氮蒸馏装置1.电炉2.蒸汽发生烧瓶3.玻璃管4.橡皮管6.反应室7.玻璃杯8.气水分离器9.冷凝管10.锥形瓶11.棒状玻璃塞12.废液排出管（2）样品测定取3个50毫升毫升锥形瓶，各准确加入5ml硼酸-指示剂混合液（应呈紫褐色），用表面皿覆盖备用。空白蒸馏（3）滴定全部蒸馏完毕后，用0.0106N标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。4、结果及计算次数123滴定（ml)1.421.381.40空白：0.05ml滴定平均值：1.40ml样品的总氮含量(克氮/%)=(1.35×10-3×0.0106×14)÷2×100=7.155mg/ml若测定的样品含氮部分是蛋白质(如血清)则：样品中的蛋白质含量(克/%)=(A-B)×10-3×0.0106×14×6.25×100C蛋白质含量：44.71875mg/ml式中：A为滴定样品用去盐酸平均毫升数；B为滴定空白用去盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数；0.0100为盐酸的当量浓度(实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写)；14为氮的原子量；6.25为系数(1ml0.0106N盐酸相当于0.14mg氮)。若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。首先，需向样品中加氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测验定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含量氮量，得出非蛋白氮量及总氮量，从而计算出蛋白质，再进一步折算出蛋白质含量。蛋白氮=总氮-非蛋白氮蛋白质含量(克/%)=蛋白氮×6.25五、实验讨论1、在将样品加入凯氏烧瓶底部时，注意不要将样品沾于凯氏烧瓶口部和颈部；且在消化时应时刻注意避免黑色消化物溅到瓶口，瓶颈壁上；这些都会影响测量结果。如果不小心出现了上述情况，应尽量将其用消化液冲洗下。2、在向反应室内加NaOH溶液时，一定要轻轻转动加样口上的盖子，不可将开口打的过开，否则，不但会使一部分氨气逃出，带来实验误差，还容易出现倒吸现象，使实验失败。3、本次实验，滴定管的装样环节比较困难，可以一人捏住滴定管下方的玻璃球，一人用洗耳球在上方吸。注：不要使滴管尖嘴部分离开液面，防止形成气泡4、每次蒸馏过后都应清洗干净，并且在蒸馏时，切忌火力不稳，以免发生倒吸现象。5、测定标准硫酸铵和空白的目的是：1）、为了验证装置有没有洗干净。2）、为了熟悉实验操作6、本实验定氮的目的是确定样品中蛋白的含量，使用凯氏定氮法测定蛋白含量具有许多优点。该方法可用于食品的蛋白质分析，操作相对比较简单，实验仪器和实验试剂相对比较便宜，并且结果准确，是一种测定蛋白质含量的经典方法。但本方法最大的缺点在于最终测定的是总氮，而不仅仅是蛋白质氮，并且实验的时间太长，关于这一点在本次实验中深有体会。除了凯氏定氮法，测量蛋白含量常用的方法还有双缩尿法、Folin－酚试剂法和紫外吸收法。其中Folin－酚试剂法在先前的实验中已经做过，这种方法灵敏度高并且操作简便、快速，但准确度相对不高，且有的检测不可用。每一种方法都有其优点与不足，方法的选择要由实际情况来定。六、思考题1.指出下列试剂的作用：(1)消化含氮样品时使用的浓硫酸、硫酸钾及硫酸铜粉末。分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜与及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。(2)蒸馏滴定中的30%氢氧化钠溶液、2%硼酸溶液及2%硼酸溶液中的指示剂。NaOH参与反应，使氨容易蒸出；硼酸溶液收集氨；本指示剂在pH5.2时为紫红色，在pH5.4为暗蓝(或灰色)，在pH5.6为绿色。变色点PI=5.4，所以指示剂的变色范围很窄pH5.2-pH5.6，极其灵敏。2.指出本测定方法产生误差的原因。造成误差的原因有：1、仪器洗涤：虽然接收瓶内指示剂不变色，但指示剂的变色有一定的变色范围，也就使实验过程中的仪器内含有少量的含氮类物质，造成了一定的误差2、滴定误差：实验的滴定终点的颜色的判断会引入一定的误差由此可见，仪器准确率可以保证在较小范围内，固可以进行样品的测量。七、注意事项1、凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官及食品等成组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到精确的结果。其缺点是操作比较复杂，含有大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果偏高。2、普通实验室中的空气中常含有少量的氨，会影响结果，所以操作应在单独洁净的房间中进行，并尽可能快地对硼酸吸收液进行滴定。3、定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。蒸馏时需控制火力以避免样液倒吸。4、消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。5、消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。6、蒸馏时，加入的氢氧化钠溶液除与硫酸铵作用外，还与消化液中的硫酸和硫酸铜作用。若加入的氢氧化钠不够，则溶液呈蓝色，不生成褐色的氢氧化铜沉淀。所以，加入的氢氧化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。7、蒸气发生瓶内的水装至2/3体积并且保持酸性（在蒸气发生瓶内的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，内加甲基橙指示剂数滴，水应呈橙红色，如变黄时，应该补加酸），以防止在碱性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大。8、因蒸馏时反应至外层的气压大于反应室内的压力，而反应室的压力大于大气压力，故可将氨带出。所以，蒸馏时，蒸气要均匀、充足，蒸馏中不得停火断气，否则，会发生倒吸。停止蒸馏时，由于反应室外层的压力突然降低，可使液体倒吸入反应室外层，所以，操作时，应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸1min后关掉热源。