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流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测3：HLA-B27测定4：CD55／CD59测定5：干细胞检测和绝对计数6：白血病免疫分型测定7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定8：细胞周期分析9：活化血小板检测10：血小板抗体测定11：红细胞抗体测定12：粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：淋巴细胞亚群测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量1ml。2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0×109/L，应分离单个核细胞。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体2—8℃(CD45/4/8/3No.6607013CD45/56/19/3No.6607073CD4/8/3No.IM1650同型对照IgG1/IgG1/IgG1No.IM1672CD3/19No.IM1293CD3/16+56No.IM2076CD19-PC5No.IM2643Flow-Count荧光微球No.7547053)2：全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(OptilyseCNo.IM1401)液体室温3：鞘液(No.8546859)液体20L室温4：清洗液(No.8546930)液体5L室温5：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）6)需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机)报告结果报告百分数（和绝对值）操作性能精密度批内五次重复CV2％参考值(百分数（绝对值）)CD3+60.8-75.4%(1141-1880)CD4+29.4-45.8%(478-1072)CD8+18.2-32.8%(393-742)NK9.5-23.5%(175-567)Th/Ts1.05-2.03临床意义1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。Th／Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。Th／Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。方案（Protocol）1.选参数点击点击4色3色点击（命名，点击save）2.画图结果此图为CD45圈门如果做绝对计数，则填写Flow-Count的浓度选中cell/ul即可活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到相应各亚群的百分数。活化淋巴细胞表面抗原为CD3+/CD25+和CD3+/HLA-DR+。CD3+/CD45RO+是记忆型T细胞。CD3+/CD45RA+是纯真型T细胞。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量1ml。2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0×109/L，应分离单个核细胞。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体2—8℃(CD3/HLA-DRNo.IM1295CD25-PC5No.IM2646CD3-FITCNo.IM1281CD45RA-PENo.IM1834CD45RO-PENo.IM1307CD4-PC5No.IM2636）2：全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(OptilyseCNo.IM1401)液体室温3：鞘液(No.8546859)液体20L室温4：清洗液(No.8546930)液体5L室温5：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV2％参考值(百分数)CD3+/HLA-DR+3.1±1.3%CD3+/CD25+15.9±3.7%CD3+/CD45RO+3.3±1.55%CD3+/CD45RA+/CD4+20.51±3.64%临床意义1.HLA-DR、CD25、CD69是T细胞活化各个时期表达的标志性抗原，对其进行检测可以判断出疾病的进程，有助于临床疾病的辅助诊断、预后和治疗。如活化状态的监测是对机体移植免疫状况判断的最主要依据，有助于临床选择治疗方案，CD25+/CD3+5-10%提示排斥、持续增加提示应作病理活检；CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。2.正常机体内各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持一定比例，如果它们之间比例失调就会引起免疫功能紊乱，将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的发生，检测淋巴细胞各种亚群有助于疾病的诊断、预后和治疗。CD45RA、CD45RO均为T细胞的辅助分子，CD45RA+纯真型T细胞当免疫力下降时减少；CD45RO+记忆型T细胞对第二次抗原刺激极其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢性感染疾病中减少。方案（Protocol）同淋巴细胞亚群检测结果（Result）HLA-B27测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量1ml。2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0×109/L，应分离单个核细胞。4．溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体1ML2—8℃(HLA-B27/HLA-B7No.IM1502同型对照IgG1／IgG2aNo.IM1389))2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体10ML2-8℃质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC／IgG1-PE)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)洗、离心、上机测样（备注：测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果报告阴阳性操作性能精密度批内五次重复CV2％参考值阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在5.0以上，阳性率90%。临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。HLA-B27基因属于І型MHC基因，所有有核细胞上均有表达，尤其是淋巴细胞表面含量丰富，人们发现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性，超过90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表达阳性，而正常人群中仅5-10%的认为阳性。由于强直性脊柱炎症状与许多疾病相类似，临床上难以确诊，因此HLA-B27检测在疾病的诊断中具有重要意义，HLA-B27的检测是该疾病诊断和鉴