流式细胞分析.

1流式细胞术胡嘉波江苏大学基础医学与医学技术学院2•流式细胞仪（FlowCytometer简称FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。从开始设想到第一台仪器的问世,科技工作者进行了不懈的努力。随着各相关技术的迅速发展，FCM技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的工具。3•FCM仪器分为二大类：•一类为台式机，其特点为：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。BD公司的临床型FACScan也是最早可用于临床诊断的仪器。•另一类为大型机，其特点为可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。4●流式细胞仪实物BDFACSVantageBD-Calibur5•其特点是：•①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；•②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；•③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；•④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。6•概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。7流式细胞仪发展的历史•起源:1934年---细胞计数仪•雏形:1949年---Coulter计数器•1959年---B型Coulter计数器•1972年:BD(Becton-Dickinson)•第一台流式细胞仪,具有分选功能8•流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下：•液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。•光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。•电系统：把光信号转换为电信号。•9•在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。1011液流系统液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。因此，必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室是液流系统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为喷嘴。在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激光相交。12FlowCellInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid1314高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数据。低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。15散射光信号和荧光信号的检测•前向角散射：前向角散射（FSC）光与被测细胞的大小和面积有关，检测的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向的散射光信号。FSC不受细胞荧光染色的影响，常用于免疫表型分析的信号处理。16ForwardAngleLightScatter前向角FALSSensorLaser17•侧向角散射：侧向角散射（SSC）光与被测细胞的颗粒密度和内部结构有关，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感。SSC收集与激光束正交90度方向的散射光信号。1890DegreeLightScatter90度侧向角FALSSensor90LSSensorLaser19流式细胞仪产生的信号•非荧光信号颗粒度细胞大小20•上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采用这两个参数组合，可区分不同种类的细胞亚群，同时可获得细胞相关的重要信息，下图（图3-2）为FSC和SSC组成的二维散点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及粒细胞区分开。2122荧光信号•荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电子受激上升到高能级。然后受激电子迅速衰落回基态，释放过剩能量成为光子。这种能量的转换称为荧光。•能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。因为更多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所以发射光波长要高于激发光波长。荧光物质的发射波长范围叫做发射光谱。23•目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm的激光器能够激发一种以上的荧光。光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。FITC的激发光谱如图3-3所示，488nm非常接近FITC的激发光谱的峰值，所以FITC被激发时会表现出最强荧光信号，而当FITC被其波谱范围内的其它波长激发时，也会检测到荧光，但信号强度不会这么高。242526Fluorescein(FITC)400nm600nm700nmRelativeIntensityWavelength500nmExcitationEmission27Phycoerythrin(PE)400nm600nm700nmRelativeIntensityWavelengthExcitationEmission500nmFluorescentDyes28EthidiumPEcis-ParinaricacidTexasRedPE-TRConj.PIFITC600nm300nm500nm700nm400nm457350514610632488CommonLaserLines2930•对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞表面抗原标记•确认细胞类型。在细胞的混合群体中，我们使用不同的荧光染料区分细胞亚群。每个亚群的染色模式与FSC和SSC数据相结合，用于识别样本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚群的百分含量。而且，还可以对感兴趣的细胞进行再分选。31FreqFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector32PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersExampleChannelLayoutforLaser-basedFlowCytometryLaser1234Flowcell33•台式机通常配有两根激光器：第一根激光器波长为488nm。第二根为波长635nm的红二极管固态激光器。34数据分析•35ImmunophenotypingCD2CD436设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。3738•直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3FITC阳性峰。3940•统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%。41•二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19PE），右下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3FITC），右上象限•（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。42•如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%。43分选•44488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetectorPurdueUniversityCytometryLaboratories45流式细胞术的临床应用461.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态2.白血病/淋巴瘤免疫分型3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系4.干祖细胞的定量及成分分析.5.其它:血小板PAIg：粘附分子;TCR多态性检测;肿瘤癌基因及抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶;耐药蛋白的分析等等。临床常见应用47•HLA-B27检测外周血HLAB27的表达及其表达程度与强直性脊柱炎的发生有很大程度的相关性.•循环血中活化血小板（CD62P、CD63）：糖尿病伴微血管病变、冠心病、高血压病、高脂血症、脑血栓形成、短暂性脑缺血发作、脑动脉硬化患者活化血小板百分率和绝对值显著高于正常人。而糖尿病无微血管病变、周围血管病变以及深静脉血栓形成患者活化血小板水平与正常人无显著差异。PTCA后24小时发展成急性血管闭塞或高度再狭窄的患者活化血小板CD62p、CD63增多，可以用于预测PTCA后急性缺血再发作的危险性。48微转移肿瘤细胞灵敏度:10-749细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及细胞周期分析50G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle51020040060080010000751502252N4NCountsG0/G1G2/MS异倍体PI荧光强度(DNA含量)流式DNA周期示意图52定量分析1.检测细胞特异性标记物：FCM不但可以定性分析标记物，而且可以进行定量。用标记已知数量的荧光素分子的标准微球作参照，可以计算出每个细胞抗原定簇的个数。2.CD4绝对计数3.CD34绝对计数4.血小板绝对计数5.可溶性物质(如细胞因子)的高通量定量检测53血小板计数新标准(双平台法)R=红细胞数R3/血小板数R1(流式)血小板数=红细胞数(血球仪)/R(国际血液学标准化委员会(ICSH)/国际实验血液学协会(ISLH)2001)灵敏度高(1-400x109/L)，重复性好，室内/室外变异系数均很小尤其应用于血小板预输注病人的检测(阈值:20x109/L)54谢谢