流式细胞分析技术

流式细胞仪分析技术及应用第一节概述一、工作原理二、散射光的测定三、荧光测量四、细胞分选原理第二节数据的显示与分析一、参数二、数据显示方式三、设门分析技术第三节流式细胞仪技术要求一、检测样品制备二、常用的荧光染料与标记染色三、胶乳颗粒的应用四、流式细胞技术的质量控制第四节流式细胞仪技术的要求第五节、流式细胞仪的科研应用第六节流式细胞术在临床检测中的主要应用一、细胞周期和DNA倍体分析二、染色体分析三、细胞表面标志的检测1、淋巴细胞及其亚群的分析2、淋巴细胞功能分析3、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型四、肿瘤耐药相关蛋白分析五、AIDS病检测中的应用六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析七、移植免疫中的应用流式细胞术(flowcytometry,FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activatedcellsorting,FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。流式细胞术主要包括：1、液流技术2、细胞的分选和计数技术3、数据的采集和分析技术流式细胞术发展史:•1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究•1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞•1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白•1949年WallaceCoulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利•1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞•1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器•1969年VanDilla及其同事在LosAlamos,NM发明第一台荧光检测细胞计•1972年Herzenberg研制出细胞分选器•1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂•大量厂家不断生产流式细胞仪•目前国内主要流式细胞仪厂家：BecktonDickinson(BD)公司、BACKMANCOULTER公司流式细胞术的特点：流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量主要特点：单个细胞水平分析；多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度；可分析大量细胞；速度快：5000-10000个细胞/秒；统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况；分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。第一节概述流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。流式细胞仪分为三大类：一类为台式机（临床型）：BDFACSCalibur流式细胞仪特点：1、仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。2、两激光配置：488nm633nm3、检测参数：四荧光参数两个散射光参数4、分析型流式细胞仪5、应用：细胞分析检测第二类为大型机（科研型）特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。第三类为新型流式细胞仪：随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4根激光管，最多检测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到15个参数的同时分析。并且可以实现高速分选，速度达到50,000个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。BDFACSAria流式细胞仪：高速分析分选流式细胞仪；高速分析；高速分选；3根激光：488nm、633nm、375nm结合特制高性能石英杯流动室；应用：细胞分析分选、sp细胞检测流式细胞仪常检测的细胞特性细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性一、流式细胞仪的基本结构：一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。概括为三个系统结构：（1）液流系统（2）光学系统（3）数据处理系统光学测量台→电子控制台→数据采集、储存和计算机处理。光学测量台：完成光学信号测量和转换电子控制台：将转换的电脉冲信号进行整形、放大并模数转换成数据信号→数字信号→最后送入电子计算机里储存处理→输出直方图、二维点图、等高图、三维图以及其他统计结果。1、液流系统由样本和鞘液组成待测细胞→单个细胞的悬液→荧光染料标记的单抗对其染色→受清洁气体压力→从样品管进入流动室形成样本流鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从Bernoulli方程：P=(1/2)PV（勿略高度的变化）真空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，一个恒定的压力（压力的大小由工厂设定），这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。2、激光源和光学系统激光光源：采用气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管（PMT）：FSC,SSC（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）激光光源与光束成形系统大多采用氩离子气体激光器：激光（Laser）是一种相干光源，提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22×66μm即短轴稍大于细胞直径的光斑（见图1-2-6）。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。光学系统由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3类：1、长通滤片：（long-passfilter,LP）：LP500滤片允许500μm以上光通过，而500μm以下光吸收或返回。2、短通滤片（short-passfiltr,SP）：与长通滤片相反，如SP500滤片允许500μm以下光通过，500μm以上光吸收或返回。3、带通滤片（band-passfilter,BP）：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。3、数据处理系统:主要由计算机及其软件分析系统组成二、流式细胞术的工作原理采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。细胞分选：高精度分选，纯度达90%-99%（细胞活性不受影响）基本过程图A流式细胞仪与显微镜的区别区别流式细胞仪显微镜光源激光自然光、灯光对象细胞、生物粒子细胞、组织等承载工具鞘液及流动室载玻片检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT、放大电路目镜×物镜、光学放大统计计算机，5000人工，200结果多参数，综合分析简单，单参数1、参数测量原理（1）、散射光的测量•散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。•细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为:•前向散射光（forwardscatter,FSC）（0°散射）•侧向散射光（sidescatter,SSC）（90°散射）。•散射光信号波长与激光相同。前向散射光（forwardscatter,FSC）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。侧向散射光（sidescatter,SSC）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。目前采用FSC（表示细胞大小）SSC（表示细胞内颗粒的复杂程度）这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群（2）、荧光信号（FL）测量•当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：•一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号；•另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于90o方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件（滤光片、双色分光镜等），可以获取荧光信号。•通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1、FL2进行检测和定量分析，了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。•荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同，可以显示不同的荧光颜色如红色、绿色、蓝色等。•每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管（PMT）。•一般有两类放大器：线性放大器和对数放大器荧光染料的特性：激发波长(EXCITING)、发射波长(EMISSION)常用荧光染料:•常配置的激光器波长为488nm•通常采用染料：•碘化丙锭(propidiumiodide，PI)、PI630nm•藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、PE575nm•异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）FITC525nm•PE-CY5等。•633nm激光器常用染料有•APC•APC-Cy�•①荧光信号的线性测量与对数测量：•主要由电子线路来完成•当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管（PMT），PMT将光信号转换成电信号。•电信号输入到放大器放大，放大器分两类：•线性放大和对数放大•线性放大器：即放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。•②荧光信号的面积和宽度•所谓荧光信号的面积：采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA含量测量时，采用面积(FL2-A)，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量，当形状差异较大，而DNA含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。•荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA样本极易聚集，当两个G1期