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流式细胞术之流式细胞仪的结构与原理韦俊2013.08技术专题概念•流式细胞仪(flowcytometer,FCM)是集现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备，是生命科学研究领域中先进的仪器之一。•流式细胞术(flowcytometry)就是利用利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。流式细胞仪的发展历史•起源:1934年---Moldvan毛细管细胞计数仪•雏形:1947年---Coulter细胞计数器•1953年---第一台流式细胞分析仪CoulterCounterModelA•1974年世界上第一台激光流式细胞仪FACS-I•1975年研制出世界上第一台带计算机的流式细胞仪•1997年世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪•2003年世界上第一台单激光五色的流式细胞仪•2009年世界上第一台三激光十色的分析型流式细胞仪•……•自1981年，北京师范大学生物系引进中国第一台流式细胞仪（FACSⅢ，•BDIS）至今，各种型号的流式细胞仪在国内安装使用已超过400台厦大分析测试中心流式细胞仪Beckman公司EPICSXL分析型流式细胞仪BD公司FACSVantageSE分选型流式细胞仪流式细胞仪的特点•实现对单列细胞或生物颗粒进行逐个检测；•实现高通量检测，最快可达数万个每秒；•可进行多参数测量，并具有明显的统计学意义；•定性或定量分析细胞；•分选特定性状或功能的细胞。流式细胞仪的基本结构四大模块：•液流系统•流动室•鞘液SHEATH•样本流SAMPLE•光学系统•光源•滤片•信号检测与转换系统•放大电路•光电倍增管PMT•分析系统•计算机•分选系统液流系统•流动室：仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。•液流驱动系统（压力泵）：空气泵+压力传感器流式细胞仪的流动室和液流驱动系统InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流体的聚焦高流速适用于定性测量，样本流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数据。低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。光源系统•激发光源：需要良好的单色性和单向性•按光源种类：弧光灯和激光器•按冷却方式：空气冷却激光器和水冷却激光器•BD公司FACSVantageSE分选型流式细胞仪：488nm和紫外同时激发的CoherentEnterprise水冷激光器；633nm的空冷氦-氖激光器•Beckman公司EPICSXL分析型流式细胞仪：488nm氩离子空冷激光器光学系统•FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和分光镜等光学元件组成•其主要光学原件是滤光片，主要分成4类：长通滤片(long-passfilter，LP)：允许长于设定波长的光通过；短通滤片(short-passfilter，SP)：允许短于设定波长的光通过；带通滤片(band-passfilter，BP)：允许一定带宽的波长通过；二分镜(dichroicfilter)•它们分别将不同波长的光信号送入到不同的探测器。LONG(700nm)550LongPass(650LP)650ShortPass(600SP)SHORT(500nm)PassThroughFilters600/100BandPass(600/100)Transmitted650nm550nm550-650nm(600?0)WavelengthsBlocked650nm550nm550nm&650nmShortPassLongPassBandPassLONG(700nm)550LongPass(650LP)650ShortPass(600SP)SHORT(500nm)DichroicFiltersTransmitted650nm550nmDiflected90?650nm550nmPMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser1234流式细胞仪的光信号•散射光信号：散射光分为前向角散射(forwardscatter，FSC)和侧向角散射(sidescatter,SSC)，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。•前向角散射光检测细胞相对大小及其表面积•侧向角散射光检测细胞内相对复杂性前向散射光（FSC）FALSSensorLaser前向散射光（FSC）侧向散射光（SSC）FALSSensor90LSSensorLaser侧向散射光（SSC）荧光信号荧光检测器FreqFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)信号检测与转换系统•当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT将光信号转换成电信号。•电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。电信号的放大•细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。•在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来通常使用对数放大器。细胞分选系统细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体产生机械振动不充电充电电荷分选原理下期预告•染料选择•样本设置•样本制备•数据分析•应用举例