流式细胞术原理简介.

流式细胞术原理简介流式基本概念流式细胞仪的结构流式细胞仪的工作原理流式的检测信号数据存储与分析流式基本概念流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。流式细胞仪（FlowCytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。特点检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量细胞，这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速率进行测量。可同时分析单个细胞的多种特征使用不同荧光素标记的单克隆抗体或荧光染料对细胞进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，可获得单细胞的多种信息。检测样本可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。样本制备单细胞悬液（天然，机械研磨/消化），5×105～1×107cells/ml，约0.5ml，300目筛网过滤。流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量……细胞功能•细胞表面/胞浆/核的特异性抗原•细胞活性•细胞内/外的细胞因子•激素结合位点、细胞受体•蛋白磷酸化•pH值•钙离子浓度•细胞膜电位、线粒体膜电位……在上述信息基础上的细胞分选液流系统光学系统电子系统流式细胞仪的结构1.液流系统液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid鞘液(Sheathfluid)作用1.避免堵塞喷孔2.约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度3.保持细胞活性流动室对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而提高采样分析速度。2.光学系统激发光学系统激光器（C6：488nm&640nm）透镜和反射镜接收光学系统滤光片如何将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光波长范围。460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50LongpassShortpassBandpassLongpassShortpassBandpass3.电子系统-将模拟信号转化为数字信号-计算每个脉冲峰的高度，宽度和面积-和计算机连接以传出数据流式细胞仪的工作原理样本收集及处理免疫荧光染色上机检测数据分析制备单细胞悬液1-1.散射光信号当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。FSC一般表征细胞相对大小及其表面积。与激光束垂直的称为侧向角散射光信号（SSC）。SSC一般表征细胞粒度及细胞内相对复杂性。RightAngleLightDetectorCellComplexitySSCForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSCIncidentLightSource1-2.荧光信号荧光素某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧光的物质称为荧光素。激发光谱（Excitation，Ex）-是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。-一般标注的是吸收波峰，也就是最大吸收波长：Ex-Max发射光谱（Emission，Em）-是指荧光素发射的一定波长范围内的荧光。所有荧光都是宽谱发射。-一般标注的是发射波峰，即最大发射波长：Em-Max荧光素的使用-选择正确的激光器（488nm&640nm。。。）-确定所需探测器（PMT）常用染料FITC可被488nm激光激发，Em-Max：525nm，可以用530/30接收通道来接受荧光信号。FITC的激发与发射光谱400nm500nm600nm700nmRelativeIntensityWavelengthExcitationEmission300nm400nm500nm600nm700nm400nm500nm600nm700nmRelativeIntensityExcitationEmission300nm400nm500nm600nm700nm常用染料PI同样可被488nm激光激发，Em-Max：625nm，所以配用不同的585/42接收通道PI的激发与发射光谱ExcitationEmission300nm400nm500nm600nm700nm常用染料APC可被640nm激光激发，Em-Max：660nm，可以配用660/20接收通道。APC的激发与发射光谱数据存储和分析常以列表模式（LISTMODE)：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储FSCSSCFL1FL2Event13060638840Event210016024585Event3300650160720FITC/PE双染样本数据显示直方图（Histogram）二维点图（DotPlot）等高线图（ContourPlot）密度图（Density）三维图（3DPlot）等机械损伤细胞：AnnexinV-/PI+晚期凋亡、坏死细胞：AnnexinV+/PI+早期凋亡细胞：AnnexinV+/PI-活细胞：AnnexinV-/PI-数据显示-散点图X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。X坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，可以是线性或对数坐标。Y坐标一般是相对细胞数。数据显示-直方图等高线图和密度图THANKS!