流式细胞相关操作

1型糖尿病药物疗效的流式细胞仪操作原理：体内各T淋巴细胞亚群相互作用维持着机体的正常免疫功能,在保护机体免受各种病原体感染的过程中起着重要的作用。CD3、CD4、CD8均为随T细胞分化过程出现的抗原故又称T细胞分化抗原。CD3抗原分布于所有成熟的T细胞膜上,是所有的T细胞都具有的分化抗原,也是鉴定外周血中T细胞的最好标志。CD4和CD8亚群是一对相互排斥的分化抗原,正常人CD4+T细胞约占T细胞总数的65%,可分为Thl和Th2两个亚群。CD4+多为辅助性T细胞(Th),通常是识别抗原递呈细胞表面与MHCⅡ类分子结合的抗原,具有辅助体液免疫和细胞免疫的功能。Thl、Th2细胞依赖它们产生的细胞因子还有相互调节和制约作用。CD8分子多由抑制性T细胞(Ts)和细胞毒性T细胞(CTL)表达,是鉴定此两种细胞亚群的主要标志。Ts细胞在免疫应答中主要起抑制性调节作用,通过抑制Th细胞的活性,抑制抗体形成和细胞介导免疫应答的作用。CTL细胞具有细胞毒活性可以杀伤带有抗原的靶细胞。CD4/CD8正常机体为1.5以上。一般认为CD4+T细胞减少,CD4/CD8下降,意味着机体免疫功能低下。。本实验主要观察小鼠脾脏中的Th1、Th2、Treg、Th17细胞。主要选取的抗体有：CD3，CD4，CD8，Foxp3＋，RoRγt＋，T-bet＋等。流式细胞分析T细胞亚型处死各组小鼠，每组3只，取脾脏，遵照相关流式操作流程处理脾细胞。，封闭液来自正常小鼠或大鼠血清（表2.2），每组检测8个不同的指标，分别设为空白对照管、CD4＋管、CD4＋CD25＋管、Foxp3＋单标管、Foxp3＋/CD4＋CD25＋管、RoRγt＋/CD4＋管、T-bet＋/CD4＋管和GATA-3＋/CD4＋管（表2.3）[6]。Table2.1Propertiesofantibodiesusedinflowcytometricanalysis.HostIsotypeReactivityConjugateCat.No.Anti-CD4RatIgG2b,kappaMouseAPC-eFluor78047-0041-80Anti-CD25RatIgG1,lambdaMousePE12-0251-81Anti-Foxp3RatIgG2a,kappaMouseAlexaFluor48853-5773-80Anti-RoRγtRatIgG1,kappaMousePE12-6981-80Anti-T-betMouseIgG1,kappaMousePE12-5825-80Anti-GATA-3RatIgG2b,kappaHuman,MousePerCP-eFluor71046-9966-41AllsixantibodieswerepurchasedfromeBioscience.Table2.2SerumandantibodiesusedforstainingcorrespondingTcellssubsets.BlockingforFCRCell-surfaceantibodyBlockingfornuclearreceptorNuclearantibodyTregsRatserumCD4，CD25RatserumFoxp3Th17RatserumCD4RatserumRoRγtTh1RatserumCD4MouseserumT-betTh2RatserumCD4RatserumGATA-3Table2.3Subjectsandantibodiesintheminvestigatedinthisstudy.设定管/组需加抗体空白对照管—CD4＋管+CD4CD4＋CD25＋管+CD4、CD25Foxp3＋单标管+Foxp3Foxp3＋/CD4＋CD25＋管+Foxp3、CD4、CD25RoRγt＋/CD4＋管+CD4、RoRγtT-bet＋/CD4＋管+CD4、T-betGATA-3＋/CD4＋管+CD4、GATA-3详细步骤如下：1、获取脾脏，加入5-10mLeBioscience®流式染色缓冲液(eBioscienceCat.No.00-4222)，使用3mL注射器注射心研磨组织。2、收集经研磨获得的细胞悬液，共10mL，过滤（消除细胞团块和碎片）至离心管中。3、裂解小鼠脾脏红细胞，通常一个脾脏使用5mL裂解液，裂解5分钟左右，最长不超15min。裂解至溶液透亮后加入2倍以上体积的PBS，终止裂解。4℃，1000rpm离心5min，PBS洗涤一次。4、4℃，1000rpm离心5min，用少量染色缓冲液重悬并计数和活力分析。5、4℃，1000rpm离心5min，用染色缓冲液调整细胞浓度为1×107/mL。6、封闭FCR介导的非特异性反应：染色之前加入适量的大鼠血清，2-8℃或室温孵育20min。7、等分细胞悬液，每管50uL（2×105-108），再补加50uL染色液。8、按照抗体说明书加入适量抗体，轻弹混匀。CD4抗体溶液和CD25抗体溶液加入剂量都为1μL。9、避光，4℃，30min。10、用2mL/管的流式染色液洗，室温1000rpm离心5min，重复两遍。11、最后一次离心后，离心完全弃上清。12、加1mLFoxp3Fixation/permeabilization工作液，涡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。13、每管加2mL1×permeabilizationbuffer。14、1000rpm离心5min，弃上清。15、加100uL1×permeabilizationbuffer重悬细胞后，加入2uL（2%）的大鼠/小鼠血清，室温孵育15min。Foxp3、RoRγt、GATA-3抗体染色用大鼠血清封闭；T-bet抗体染色用小鼠血清封闭。16、封闭液无需洗去，直接加入稀释好的荧光标记核因子抗体（用PermeabilizationBuffer工作液进行稀释）20uL，室温避光孵育至少30min。本实验中Foxp3、RoRγt、T-bet、GATA-3抗体分别取0.5μL、1μL、2.5μL、5μL原液。17、2mL1×permeabilizationbuffer洗一次，1000rpm室温离心5min,弃上清。18、加2mL流式染色液，1000rpm室温离心5min,弃上清。19、适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。抗体价格表达科为代理Bioledgen的价目表：BD的价格最近有优惠活动，打到4.5折。具体价格以BD官网价格（=CD3&x=9&y=13）为主，比如CD4的抗体，25μL折后价格为415元。金亮老师那边主要用BD的。eBioscience公司（），上届师兄主要用的这个，价格还在询问中，目前，师兄没有回复。