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《临床流行病学》试卷学期：2014年秋学院：第二临床医学院年级：2014级专业：肾内科姓名：李敏学号：220140902060循环miR-155与糖尿病肾病的前瞻性队列研究姓名：李敏学号：220140902060报告正文1.立项依据与研究内容（4000-8000字）（1）项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）1）开展糖尿病肾病机制研究，防止糖尿病肾病是国家的重大需求糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是常见而严重的糖尿病并发症，其发生率约为糖尿病患者的20%-40%。在西方国家DN已成为终末期肾病（endstagerenaldisease，ESRD）的第一位原因，也是糖尿病致命的主要原因。在美国每年进入血液透析的患者中，约50%为糖尿病肾病﹝1﹞。在我国，DN在ESRD原因中的比例亦逐年增加，已经成为ESRD的第二位病因。2010年中国98,658名18岁以上人群流行病学调查结果：中国成年人糖尿病患病率11.6%，患者约1.14亿；糖尿病前期患病率估计为50.1%，患者约4.93亿〔2〕。以糖尿病肾病患者经过10～20年50%发展至ESRD计算，未来10～20年我国新增糖尿病肾病引发的尿毒症患者1500万，每年75～100万。将给我国社会经济发展带来沉重负担。但由于糖尿病肾病的发病机制仍不十分清楚，现有的临床治疗一般只能减慢DN向肾功能衰竭的进程，而无法逆转或阻止病情发展，因此研究糖尿病肾病的发病机制是糖尿病肾病防治的关键环节，是国家的重大需求。2）肾小球内皮细胞损伤是糖尿病肾病发生发展的关键环节研究证实肾小球内皮细胞（glomerulusendothelialcell，GEnC）的损伤或激活在DN的发生及发展中其重要作用〔3,4〕。首先，GEnC是特殊的毛细血管内皮细胞，是肾小球滤过屏障的重要组成部分，它具有特殊的内皮窗孔结构。在血流动力学上，它承载着高于一般毛细血管内皮细胞的血流压力，其主要功能是滤过屏障而非物质交换。因此，它不同于一般的大血管、微血管和毛细血管内皮细胞，更易受到损伤。其次，GEnC与肾小球基底膜和肾小球系膜细胞紧密相连，所以GEnC的损伤往往可以导致系膜细胞的病变〔5〕。有研究认为GEnC的损伤，可能是肾小球系膜细胞病变及肾小球硬化的始动因素〔6〕。再次，GEnC可能在某种程度上决定了肾小球基底膜的内在性生化和生理特征，其功能的异常可能参与了糖尿病肾脏功能异常及蛋白尿的产生。总之，由于GEnC在肾脏的特殊位置，易受血液中物质如血糖、血脂和炎症介质影响，因而在DN发病中首当其冲。既往研究认为DN患者持续性血糖代谢紊乱〔7〕、胰岛素抵抗（Insulinresistance,IR）〔8,9〕及脂毒性刺激〔10〕等均可导致血管内皮功能紊乱，诱导内皮细胞表型转化或凋亡。血管内皮损伤又会加重相关细胞因子调控网络紊乱，形成恶性循环，一方面在肾脏促进肾小球系膜外基质成分产生增多、基底膜增厚、PTC网减少，加重DN肾小球硬化和肾间质纤维化；另一方面，诱导大血管内皮受损，引起心血管事件的高发生率。因而针对糖尿病及DN发病过程中肾脏血管内皮功能异常变化的深层次机制研究，对寻找防止DN的新靶点具有重要意义。3）microRNA-155及其相关靶基因可能参与糖尿病肾病的血管内皮细胞的损伤MicroRNA（miRNAs）是近来发现的一类调节基因表达的非编码RNA，长度为20-22bp，由基因组转录。MicroRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而调控蛋白表达〔11〕。血清循环microRNA是存在于细胞外的microRNA特殊存在方式〔12〕，其具备调节靶基因的功能，因此在疾病的发病机制中具有重要的作用。我们前期开展了糖尿病患者血清microRNA谱检测，发现与健康对照组比较糖尿病肾病组早期血清miR-150、miR-155-5p、miR30e及miR-3196水平显著下降，其中miR-155的表达水平在微量蛋白尿组和大量蛋白尿组对比有显著差异（P＜0.05），并与DN患者eGFR呈正性相关，与患者的尿蛋白排泄率呈负性相关。已有的研究表明，microRNA-155参与细胞的分化、增殖、凋亡以及多种生物组织的发育调节过程。近期研究发现microRNA-155在调节心血管疾病的发病机理中起着重要作用〔13,14〕。MicroRNA-155在自发性高血压的大鼠主动脉上表达明显低于正常对照组，并与血压呈负相关，microRNA-155和血管紧张素受体1（AT1R）共同表达于血管内皮细胞和平滑肌细胞上，通过抑制AT1R的表达来控制血压及血管内皮细胞的炎症状态。在患有冠状动脉疾病患者的血清中发现的miRNA-155水平明显下调，提示循环miRNA-155可能参与了患者的心血管事件〔15,16〕。近期huang等的研究发现miRNA-155在糖尿病肾病患者肾组织表达增高，且主要表达于肾小球血管内皮细胞、系膜细胞和肾小管间质。并且体外实验证实同空白对照组比较，miR-155在高糖刺激2小时后在肾小球血管内皮细胞表达上调，在4小时达到顶峰，然后减少。并认为miR-155的表达增高，与TNF-ɑ、TNF-β1和NF-κB的表达增高相关，共同参与了炎症介导肾小球内皮细胞损伤〔17〕。我们通过在线靶基因预测软件TargetScan筛选了KIAA1274、ETS1、CYR61三个与血管内皮站爱相关的新靶基因作为候选靶基因，并进行双荧光素酶报告发验证，证实ETS1位miR-155的靶基因之一。ETS-1属于E26转化特异序列（E26Transformation-specificSequence,ETS）转录因子家族，它是一个血管内皮细胞特异的转录因子，在血管发育、血管新生、血管重构和炎症反应中扮演重要角色〔18〕。已有研究报道，AngⅡ、血栓素、TNF-ɑ等物质均能激活ETS-1在血管内皮和平滑肌细胞的表达〔19〕。此外，另有研究发现ETS-1还是与内皮细胞炎症相关的VCAM-1和MCP-1以及与氧化应激相关NAD(P)H氧化酶亚单位P47的重要转录因子〔20,21〕。推测相关血管活性物质或细胞因子很可能通过激活ETS-1在内皮细胞的表达进而引发内皮炎症反应。基于理论认识和前期工作基础，我们认为循环miR-155可能参与了糖尿病肾脏损伤的发生机制，并与糖尿病肾病肾小球血管内皮细胞损伤有关，并且循环miR-155有可能作为生物标志物用于糖尿病肾病的预警和早期诊断。然而循环miR-155如何与其靶标mRNA相互作用，进而发挥其在DN中调控作用的机制尚不十分清楚。在前期工作中，我们筛选出ETS1、eNOS、AGTR1等靶基因，验证miR-155通过调控这些靶基因导致血管内皮细胞功能障碍，促进糖尿病肾病的发生发展。用体外细胞实验验证了miR-155对肾小球内皮细胞功能障碍的调控作用，也通过建立糖尿病动物模型，明确循环miR-155在糖尿病和糖尿病肾病发生进展中的作用。通过本项研究将验证循环miR-155在糖尿病和糖尿病肾病患者中的水平，为临床预警和早期诊断糖尿病肾病、以及寻找干预新靶点提供实验证据，促进糖尿病肾病的防治，具有重要的科学价值和临床意义。参考文献〔1〕SatirapojB.Nephropathyindiabetes.AdvExpMedBiol,2012,771:107-22.〔2〕XuYl,WangL,HeJ,BiY,LiM,WangT,WangL,JiangY,DaiM,LuJ,XuM,LiY,HuN.PrevalenceandcontrolofdiabetesinChineseadults.JAMA,2013,310(9):948-59.〔3〕ChengH,HarrisRC.Renalendothelialdysfunctionindiabeticnephropathy.CardiovascHematolDisordDrugTargets,2014,14(1):22-33.〔4〕HuangY,LiuY,LiL,SuB,YangL,FanW,YinQ,ChenL,CuiT,ZhangJ,LuY,ChengJ,FuP,LiuF.Invovlementofinflammation-relatedmiR-155andmiR-146aindiabeticnephropathy:implicationsforglomerularendothelialinjury.BMCNephril,2014,15:142.〔5〕FuJ,LeeK,ChuangPY,LiuZ,HeJC,Glomerularendothelialcellinjuryandcrosstalkindiabetickidneydisease.AmJPhysiolRenalPhysiol,2014,ajprenal.00533.2014.〔6〕WadaT,ShimizuM,YkokyamaH,IwataY,SakaiY,KanekoS,FuruichiK.Nodularlesionsandmesangiolysisindiabeticnephropathy.ClinExpNephrol,2013,17(1):3-9.〔7〕VanSlotenTT,HenryRM,DekkerJM,NijpelsG,UngerT,SchramMT,StehouwerCD.Endothelialdysfunctionplaysakeyroleincreasingcardiovascularriskintype2diabetes:theHoornstudy.Hypertension,2014,64(6):1299-305.〔8〕SyedIkmalSI,ZamanHuriH,VethakkanSR,WanAhmadWA.Petentialbiomarkersofinsulinresistanceandatherosclerosisintype2diabetesmellituspatientswithcoronaryarterydisease.IntJEndocrinol,2013,2013:698567.〔9〕TetaD.InsulinResistanceasaTherapeuticTargetforChronicKidneyDisease.JRenNutr,2014.〔10〕NosadiniR,TonoloGRoleofoxidizedlowdensitylipoproteinsandfreefattyacidsinthepathogenesisofglomerulopathyandtubulointerstitiallesionsintype2diabetes.NutrMetabCardiovascDis,2011,21(2):79-85.〔11〕FigueiraMF,Monnerat-CahliG,MedeiE,CarcalboAB,MoralesMM,LamasME,daFonsecacardiovascularandrenalsystems.ActaPhysiol(Oxf),2014,211(3):491-500.〔12〕OsipovaJ,FischerDC,DangwalS,VolkmannI,WideraC,SchwarzK,LorenzenJM,SchrevierC,JacobyU,HeimhaltM,ThumT,HaffnerD.Diabetes-associatedmicroRNAsinpediatricpatientswithtype1diabeyesmellitus:across-sectionalcoortstudy.JClinEndocrinolMetab,201,99(9):E1661-5.〔13〕StaszelT,ZapalaB,PolusA,Sadakier