流式细胞仪的原理及应用

流式细胞仪的原理与使用一、定义流式细胞仪（flowcytometer）：是集光电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学、单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术（flowcytometry,FCM）：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识及技术。二、基本结构1.流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管、喷嘴等组成，由透明稳定的材料（化学玻璃、石英等）制成，是液流系统的核心部分。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力下从样品管射出。鞘液由鞘液管由四周流向喷孔，包围在样品外周后由喷嘴射出。2.激光源和光学系统光源根据被激发物质的激发光谱而定，常用弧光灯和激光。常用的弧光灯为汞灯，激光器多为氩离子激光器、氪离子激光器或染料激光器。经过特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发荧光供收集检测。3.光电管和检测系统荧光染色或荧光标记后的细胞受到合适的光激发后产生的荧光通过光电转换器转变为电信号进行测量。通常使用光电倍增管（PMT）。PMT响应时间短，为ns数量级，具有较强光谱响应特性，200～900nm光谱区内光量子产额较高，其增益从103到108可连续调节，有利于弱光的测量。由PMT输出的电信号放大后输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器。一类为线性放大器，即输出信号辐度与输入信号成线性关系，适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如DNA测量。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。免疫分析时需要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，其荧光强度相差1～2个数量级；在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。4.计算机和分析系统放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数与电信号脉冲高度相对应，与光信号强弱相关。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，存储于计算机或仪器内可供调用。计算机可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，得出最终结果。三、工作原理1.参数测量原理流式细胞仪可以在测量区内同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量区即是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。由于一些生物学参数与细胞对光线的反射、折射等光学特性有关，因此散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关。未遭受任何损坏的细胞对光线具有特征性的散射，因此可以利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还与散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。2.样品分选原理流式细胞仪的分选功能由细胞分选器完成。由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，之后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中，其它液体被当作废液抽吸掉。某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选。稳定的小液滴由流动室上压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂形成。液滴间距约距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率（v:液流速度，d:喷孔直径）。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可以改变分选效果。充电电路和偏转板共同完成分选的含细胞液滴在静电场中的偏转。充电电压多为+150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器由逻辑电路控制，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位寄存器数字电路产生延迟。可以根据具体要求予以适当调整。3.数据处理原理①数据显示：方式包括单参数直方图(histogram)、二维点图(dotplot)、二维等高图(contour)、假三维图(pseudo3D)和列表模式(listmode)等。直方图既可以用于定性分析，又可以用于定量分析，形同一般X—Y平面描图仪的曲线。根据选择放大器类型不同，横座标可以是线性标度或对数标度，用“道数”(ChannelNo.)来表示，实质上是所测荧光或散射光的强度。纵座标一般表示细胞相对数。但直方图只能显示一个参数与细胞之间的关系。二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横座标和纵座标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应座标值的细胞存在。可以由二维点图得到两个一维直方图，但由于兼并现象存在，二维点图的信息量大于二个一维直方图的信息量。兼并即多个细胞具有相同的二维座标，在图上只表现为一个点。对于细胞点密集的地方难于显示它的精细结构。二维等高图类似于地图上的等高线表示法。是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数越多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，等高线越密集表示变化率越大，越疏表示变化平衡。假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐座标—细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节，有助于对数据进行分析。②数据分析：分为参数方法和非参数方法。被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时多使用参数方法。数学模型可以是一个方程或方程组，方程的参数产生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠精子的DNA含量时，可以获取细胞频数的尖锐波形分布。如果采用正态分布函数来描述这些数据，则参数即为面积、平均值和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。而非参数分析法对测量得到的分布形状不需要做任何假设，即采用无设定参数分析法。分析程序可以很简单，只需要直观观测频数分布；也可能很复杂，需要对两个或多个直方图逐道地进行比较。四、仪器使用1.样品处理流式细胞仪的测量对象是单个细胞或细胞核的悬液，上机前必须将样品分散成单个细胞。分散后的细胞应尽可能保持原细胞的结构和功能状态，细胞群体的比例不能破坏，细胞不能成团，碎片应尽可能少。流式细胞仪主要测量所用燃料的荧光信号。染色时的孵育时间、孵育温度、孵育混合物的搅拌程度，染料的浓度以及细胞浓度均会影响染色的效果，需经过反复摸索选定合适条件。大多数染料见光易分解，因此染色过程中应尽量避光。上机前应用合适孔径的筛网过滤悬液，以免大颗粒堵塞仪器的管道系统。2.仪器操作①打开电源，对系统进行预热；②打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0°和90°散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；⑦因为实验数据已存入计算机硬盘，因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；⑧将所需结果打印出来。五、仪器机型及应用流式细胞仪根据有无分选功能分为流式细胞分析分选仪和流式细胞分析仪。目前常见一下两种：FACSAria型流式细胞仪：仪器功能强大，可配置多种激光光源，进行多色荧光参数分析（同时完成13色荧光分析）。细胞分选速度快，纯度高，自动分选系统可将细胞分选至96孔板，每孔分选1-10万个细胞。对杂交瘤细胞株筛选、克隆化培养有重要价值。FACSCalibur型流式细胞仪：机器体积小，灵巧，配置两种激光光源，可用于1-4色荧光分析。其机器配有分选装置，纯度较高，速度较慢（300个细胞/秒）。流式细胞仪在细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、药物学等学科起到非常重要的作用。