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流式鉴定细胞表面标记物实验步骤【实验流程】一.前期样品准备二.上机前样品的处理三.流式细胞仪检测四.流式检测数据分析【具体步骤】一.前期样品装备1.MCF-7贴壁细胞的CD44+呈现低表达，可以不需要鉴定该细胞的CD44和CD24了。但是可以接种一孔的MCF-7DMSO组作为调节荧光染料PE泄露到FITC通道的补偿参考。但是一般情况下，PE染料难以染上，故可人为破坏细胞作为阳性对照组，比如加药C60或者用冰冻使细胞死亡。2.MDA-MB-231贴壁细胞高表达CD44+，接种一孔的MDA-MB-231DMSO组作为调节荧光染料FITC泄露到PE通道的补偿参考。3.调整细胞浓度使细胞第二天可以铺满即可。所以前期样品准备可以按照下表：MCF-7C60组MDA-MB-231DMSO组MDA-MB-231C30组MDA-MB-231DMSO组MDA-MB-231C40组MDA-MB-231C50组注：画“——”为调补偿专用，其余为实验组，为避免细胞数目不够，实验组可以设置两个复孔。若是检测悬浮球，也可以按照以上的组别进行设置，。二.上机前样品的处理(一)实验步骤1.消化：收集旧培养基并离心，用于终止贴壁细胞的消化。贴壁细胞用200uL0.25%胰蛋白酶消化，消化5分钟，然后加2mL离心过的培养基终止消化。2.离心：800r/min,离心5min，弃掉上清液。3.重悬：加2mLPBS重悬，涡旋成单细胞悬液。将该细胞悬液转移到流式样品管中，离心，弃去上清液。加300uLPBS重悬细胞。4.调补偿组加抗体：要设置同型对照和单染，标记FITC-ISO+PE-ISO组，FITC组，PE组。每组加相应的抗体5~10ｕL。5.实验组加抗体：每个实验组都要设置同型对照，标记FITC-ISO+PE-ISO组，FITC+PE组。每组加相应的抗体5~10ｕL。6.加细胞悬液：分别吸取对应细胞悬液50uL于流式管中（此时细胞数至少为1×106/mL以上）。常温避光孵育20min。7.孵育完成后，加2mLPBS重悬细胞，1000r/min,离心5min。8.离心后垂直倒掉上清液,再加200uLPBS重悬细胞，进行上机检测。(二)注意事项1.对于悬浮球的处理，第一个步骤略有不同，步骤如下：把悬浮球吸到15mL离心管中离心弃上清，再用0.05%胰蛋白酶消化，消化5min，然后加4mLPBS终止消化。2.样品要做好标记，流式管也做相应标记。3.先加入抗体再加样品，保证抗体不会漏加，而且加抗体的短时间内并不容易发生荧光淬灭，故可以不用避光。4.离心后垂直倒掉上清液后倒置在纱布上轻轻按压，吸干管口即可，不可以甩干，不要再进行二次倾倒，以免将细胞倒掉。5.加入抗体和之后的PBS终止抗体反应、PBS重悬等均不可以用移液枪吹打，只能使用漩涡混匀器来混匀。6.消化细胞时要让胰酶自然消化，最好不要人工拍打，否则会成片脱落，影响结果的测定。上机前的细胞最好是单细胞状态，不要粘连，以免对流式细胞仪造成损伤。7.上机检测前，用锡纸把流式管包住，避光，加完抗体尽快在半小时内检测完毕，故一次性不要处理太多样品，以免发生荧光淬灭。8.BD流式抗体过期两年内若是荧光强度仍较好，还可以使用。三.流式细胞仪检测(一)开机1.开电脑，开软件，放置一管ddH2O在上样处2.开启机器，仪器自动执行“Startup”，时间大约5min，直到每秒瞬时的收集信号低于10；3.“Startup”完成后，仪器状态显示“CytometerConnectedandready”；4.推荐上样前运行ddH2O15min；(二)设定门1.先用同型对照组进行样品采集在A02孔，若是细胞群分开不清楚可以调节横纵坐标（即调电压），直到分清楚细胞群。2.点击“PLOTSPEC”，在这里采用线性模式，X、Y轴的最大值设置为默认值的一半，好区分细胞群。P1左下角是细胞碎片，P1右上方是粘连细胞。3.画门：排除细胞碎片和粘连细胞，圈定的细胞群要集中，数目若达90%以上最好。此步是对细胞进行设定。4.门画好后，设置逻辑，比如限定在P1门中收集10000个细胞。(三)调补偿1.ISO组为同型对照，为实验组真正的阴性对照，故应在左下角，根据它画好十字门。此步时对荧光抗体进行设定。2.点击等密度图或者散点图，修改横纵坐标的最小电压，比如横坐标1500，纵坐标500~800,修改门的逻辑，比如选定P1。再分象限，调补偿，SetcoLorcompensation。此处为对数模式。3.PE组一般只有死细胞才能染上，活细胞一般不能染上，故该组应收集死细胞（冻死或者用枪头将细胞破坏），验证PE是否能染上，否则不好判断PE泄露到FITC的荧光含量。4.PE阳性在左上角，FITC组阳性应在右下角。5.细胞群应按照横平竖直的原则，电压的中位线应跨过细胞群的中间部分。6.简单来说就是单染FITC阳性应该集中在右下象限，不能泄露到十字水平线的上方，单染PE阳性应该集中在左上象限，不能泄露到十字垂直线的右方，若是见到细胞群斜向一方，说明补偿没有调好。(四)样品实验组的检测前面部分设置好，就可以检测样品了。调补偿应兼顾PE、FITC、ISO，SetcoLorcompensation,横纵坐标电压等。(五)数据保存直接按FiLe→save。(六)关机1.放置一管ddH2O，运行2分钟；2.放置一管0.1%-1%有效氯的清洗液，运行2分钟；3.放置一管ddH2O，运行2分钟，运行结束后ddH2O保留在上样处；4.退出软件，关闭电脑；5.关闭电源键，仪器会自动Shutdown，时间约为13min，完成后仪器电源键自动关闭。(七)注意事项1.每次跑ddH2O均收集在A01孔，不可与其他孔混乱，跑水速度可以自定义快一些。2.门一旦设定，最好不要随意修改，圈定的细胞群若是占进样总细胞数目的比例较少，说明细胞状态不好。3.除ddH2O、有效氯的清洗液外，每个样品均要用0.7μm过滤网过滤后才能上机检测。4.跑样品速度可以选定慢速或者中速。5.每测一个样品，都BackfLush后用ddH2O清洗1分钟再测下一个样品。6.耗材仪器的准备：1.6EP管、1mL移液器、1mL一次性枪头、0.7μm过滤网、50mL离心管、有效氯清洗液等。7.一般贴壁细胞混匀后不需要用过滤网，因为会损失细胞，而悬浮球（特别是MCF-7悬浮球）容易聚集，故可视情况用0.7μm过滤网，以免堵住检测孔。四.流式检测数据分析可以用FLOWJO7.6软件或者BDAccuriC6Software软件，若样品处理好、上机检测调好补偿等，后期不需要过大的修改。