流感病毒培养的影响因素

流感病毒培养的影响因素�摘要�随着流感在全球的爆发,人们越来越重视流感疫苗的接种。流感疫苗的制备需要以流感毒株为基础,全国各地的CDC都将流感毒株的制备作为日常工作,因为刚刚开展,还有许多技术不成熟。毒株的培养有很多影响因素,例如用于培养流感病毒的细胞,试剂,操作步骤以及样品等,本文都列举出来,希望给同仁提供一定的参考,也希望大家一起来补充指正,共同提高我国流感毒株培养的水平。�关键词�流感病毒;影响因素;阳性率中图分类号:R446�6文献标识码:A文章编号:1003-6245(2010)05-0479-02作者单位:苏州市疾病预防控制中心,江苏215004作者简介:夏瑜(1980-)女,江苏苏州人,主管检验师,硕士研究生。2009年是流感大流行的一年,各国科学家均认为,防控流感除个人注重卫生之外,重要的是接种疫苗。因此我们需要进一步完善疫苗的制作及接种的具体措施,力争万无一失。目前我国疾病预防控制中心的流感网络实验室都要进行流感毒株的培养,上送我国流感中心,以便流感疫苗的研究,为以后流感的监控打下扎实的基础。但不是所有的流感咽拭子标本RNA阳性的都能培养出流感毒株,这里面有太多的影响因素。例如用于培养流感病毒的细胞,试剂,操作步骤以及样品等,本文都列举出来,希望给同仁提供一定的参考,也希望大家一起来补充指正,共同提高我国流感毒株培养的水平。1用于培养流感病毒的细胞1�1细胞株的选择在最初培养流感病毒的时候用鸡胚,但鸡胚分离流感病毒容易引起病毒便变异和过敏性反应,还存在大规模生产时外源病毒的污染问题。而运用Vero和MDCK细胞培养流感病毒不但解决了上述问题,还使得病毒的免疫原更稳定。戚凤春[1]等人研究发现,相同的实验条件下,在MDCK细胞上培养的病毒HA滴度明显高于Vero细胞,因此我们培养流感病毒细胞株的选择MDCK细胞,其代数最好小于35代,细胞过老会使病毒不容易负载。1�2细胞最佳负载病毒的胞龄MDCK细胞繁殖非常旺盛,必需只能提前一天将细胞培养瓶里的细胞接种在六孔板中,如果负载病毒用胞龄为两天的MDCK细胞,那么病毒培养的阳性率几乎为0,而胞龄为12-24h的MDCK细胞对病毒的负载阳性率区别不大[2]。1�3细胞负载病毒的最佳密度首先,MDCK细胞的密度不能太稀,这种细胞密度太稀则不能生长,也不能让细胞密得堆积起来,那样也会很大程度降低病毒接种的阳性率。最好使细胞刚刚铺满孔,这时负载病毒后收获病毒的HA滴度最高。当工作人员提前一天将细胞接种在6孔板中时,应考虑细胞的生长速度,使其第二天负载病毒时的细胞密度适当。其次,MDCK细胞接种六孔板时要密度均匀,容易出现的情况是细胞都聚集在孔的边缘,而中间密度过稀,这样也会影响病毒负载的阳性率。避免这种情况出现就要工作人员手法熟练,如果出现了这种情况,将培养板轻轻晃动(避免液体溅出),能有效改善细胞的分布。2培养流感病毒的试剂用于培养流感病毒试剂的不同也会很大程度影响病毒培养阳性率。首先,不使用过期的试剂;其次,最好使用知名厂家的试剂,比如GIBCO等;再次,使用前将试剂从冰箱拿出一段时间,最好等试剂的温度已经平衡到室温再用。如果是给细胞换代,过冷的试剂会影响细胞的生长状态;如果是负载病毒前洗细胞用,过冷的试剂会使细胞突然皱缩而病毒培养的阳性率。3样品3�1样品的存放样品存放的时间直接影响病毒负载的阳性率,标本越新鲜,病毒培养的阳性率越高。如果样品不能及时负载细胞,应将样品放在-70!冰箱中,避免反复冻融,冻融次数越多,病毒培养的阳性率越低。注意不能将样品放在-20!的冰箱中,流感病毒在-20!非常不稳定,如果当天的样本要第二天才能接种,应将样品放在4!冰箱中。3�2样品的无菌处理因为样品的采样条件不可能无菌,虽然采样液中有抗生素,也不能保证细菌全被杀死,所以阳性样本最好过滤到无菌的1�5ml离心管中备用。有些工作人员采用往细胞培养板中加抗生素避免污染,这样虽然省事,但会对细胞有伤害,从而降低了病毒培养的阳性率。4病毒负载的操作步骤4�1细胞洗涤将六孔板中的细胞培养液倒去,用HBSS洗涤每一孔三遍以上,其作用是洗去残留的FBS,FBS通过抑制胰酶而抑制流感病毒的复制。将洗液倒去后,应立即加入洗液或病毒液,过长时间将细胞暴露在空气中将很大程度降低病毒培养的阳性率,最好将细胞暴露在空气中的时间缩短在5秒以内。4�2病毒液的接种量病毒液的接种很有讲究。负载在细胞上的病毒液应大于300u,l否则不够盖过整孔细胞。待37!孵育1~2h后,不管开始负载了多少体积的病毒液,都应在每孔留300ul病毒液再加入病毒培养基,若病毒液全都弃去或留得太少,会使病毒培养阳性率大打折扣;若病毒液留得太多,比如超过400u,l也会使阳性率降低很多,因为存留过多的缺损病毒会严重影响正常病毒的复制。4�3病毒液的孵育时间理论上,病毒液在37!孵育1~2h都可以,但我们发现1h还是太短,最好在1h15min加入病毒培养基,不要时间过长,那样也会使病毒培养的阳性率降低,可能是因为采样液的pH值和病毒培养基不同,孵育时间稍长导致细胞受到损伤。而盲传的时候,孵育的时间可以到2h以上,因为这时候所用的病毒液也是病毒培养基,而不是采样液。4�4病毒培养基的配制病毒培养基是用DMEM加入HEPES和胰酶配制而成的,HEPES的作用是加强体系的缓冲能力,胰酶的作用是将病毒粒非裂解型的HA0变成裂解型的HA1+HA2,从而提高流感病毒在细胞中的复制能力,因为流感病毒只有血凝素(H)是裂解型的才具有感染性。但是HEPES和胰酶在DMEM在4!共存时间过长会引起pH值上升,所以病毒培养基我们一般都是现配现用。4�5病毒HA滴度的测定CPE出现时间随病毒的型别和毒株的差异以及感染量的大小而异。我们将标本接种后3d观察是否出现CPE,出现CPE的测定HA滴度,滴度大于8则收获病毒,用HI实验测定病毒亚型,病毒滴度小于8进行盲传,再在第3d测定HA滴度。若负载病毒7d还不出现CPE,维持液中又查不出HA活性,可认为阴性标本,弃之。据报道[1],3d时间出现病毒滴度的最高峰,4d和2d都低于3d时病毒的滴度。收获毒株前,将细胞于-80!/37!冻融一次,有利于增加病毒的HA滴度[3]。5讨论流感病毒是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒,它会造成急性上呼吸道感染并借由空气迅速的传播,在世界各地常会有周期性的大流行。流行性感冒病毒在免疫力较弱的老人或小孩及一些免疫失调的病人会引起较严重的症状,如肺炎或心肺衰竭等,从而危害人类。因为流感病毒的基因每年都有变化,所以需要各地培养当季的流感毒株,上送国家流感中心,以使生产的流感疫苗配合每年流感病毒的变化。各地CDC的这项工作都刚刚开始,许多市级CDC还未能开展,因此技术还不成熟。流感毒株的培养不但要求工作人员无菌操作,还有其特殊的技术和手法难点,以上是我们在工作中的一些经验,一定还有其他注意点未能提及,望毒株培养的同仁一起来探讨补充指正,共同提高我国毒株培养的水平,为生产高质量的流感疫苗做贡献,降低流感对人类的危害。参考文献[1]戚凤春,汪春义,张雪梅等�中国生物制品学杂志[J]�2006,19(3),291-292�[2]范东瀛陈俊英张新文等�流感病毒在不同细胞中适宜培养条件的研究[J]�第三军医大学学报�2007,29(6):510-512�[3]何春艳,陈列胜,吴书军,等�Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养[J]�中国生物制品学杂志�2007,20(2):125-128�(收稿日期:2010-02-22)∀480∀医学动物防制2010年5月第26卷第5期JMedPestContro,lMay2