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1芹菜中芹菜素的优化提取、含量分布关系及其杀菌作用的初步探究南方医科大学公共卫生与热带医学学院2010级预防医学张欢13266328947南方医科大学公共卫生与热带医学学院2010级预防医学巫文威13266342249南方医科大学第一临床医学院2010级临床医学五年钟海燕132492194752目录1前言-------------------------------------------------------------42实验目的---------------------------------------------------------43实验原理---------------------------------------------------------44实验设备---------------------------------------------------------55实验材料及试剂---------------------------------------------------56实验步骤---------------------------------------------------------57实验结果及计算---------------------------------------------------108实验预期及可行性评估---------------------------------------------159注意事项---------------------------------------------------------1510实验预算--------------------------------------------------------1611参考文献--------------------------------------------------------163摘要芹菜素是一种常见的黄酮类化合物，在芹菜中含量相对较多，具有抗炎作用。本实验欲通过正交试验法探究提取芹菜素的最适条件，并从芹菜的根、茎、叶中提取芹菜素来比较三者间芹菜素的含量，及通过与乙酰水杨酸比较来判断芹菜素的抗炎效果。关键词：芹菜素正交试验抗炎作用乙酰水杨酸41前言如今由于抗生素的滥用，细菌耐药性越来越强，研究新的不易使细菌产生耐药性的抗炎药迫在眉睫，而芹菜素很好地符合了人们的预期。研究表明，芹菜素具有抗炎作用，与其他黄酮类物质相比，具有低毒、无诱变性的特点，有望成为理想的新型抗炎药。另外芹菜素作为一种天然存在的黄酮类化合物，广泛地存在于食物中，以芹菜居多，且芹菜中根茎叶所含芹菜素量不同，研究芹菜不同部位芹菜素的含量关系为我们日常生活对芹菜取食部位和工厂优化选取原材料以获取芹菜素的方案提供参考。因而本次试验对于探究新型抗炎药和综合利用农产资源具有实际意义和良好的经济效益。2实验目的2.1用正交试验法对芹菜中芹菜素的提取工艺进行优化研究。2.2从芹菜不同部位根、茎、叶中提取芹菜素，用紫外分光光度法分别测定芹菜根、茎、叶中芹菜素的含量并比较芹菜素在不同部位的含量关系2.3究芹菜素抗炎效果的最佳剂量，以及和乙酰水杨酸抗炎效果的比较，探究芹菜素在新型抗炎药方面的应用。3实验原理3.1用正交试验法对芹菜中芹菜素的提取工艺进行优化研究。用正交试验对提取溶剂乙醇含量、料液比、提取温度及提取时间进行研究,在此基础上确定上述4个因素的最佳组合。3.2芹菜不同部位根、茎、叶中提取芹菜素，用紫外分光光度法分别测定芹菜根、茎、叶中芹菜素的含量并比较芹菜素在不同部位的含量关系芹菜素，又称芹黄素，化学名称为4’，5,7-三羟基黄酮，属于黄酮类（其结构式见图1），几乎不溶于水，易溶于甲醇、乙醇。从植物中提取芹菜素时因其多以芹菜素的C-糖苷化合物存在而微溶于水，因此用乙醇溶解并采用索氏提取法提取。查资料知芹菜素标准对照品的最大吸收波长为345nm。在用乙醇提取芹菜素前，分别用乙酸乙酯对芹菜进行预处理至提取液为无色，目的为将叶绿素等脂溶性成分除去。黄酮类化合物与1%氯化铝生成黄色络合物，并有荧光。5图1：芹菜素的结构式3.3究芹菜素抗炎效果最佳剂量以及和阿司匹林的有效成分乙酰水杨酸杀菌作用的比较从芹菜中提取的芹菜素具有抗炎作用，通过设置不同浓度的芹菜素对大肠杆菌（革兰氏阴性）和金黄葡萄球菌（革兰氏阳性）的杀菌效果来探究芹菜素抗炎效果的最佳浓度。另外，以芹菜素最佳杀菌浓度与同浓度的乙酰水杨酸比较二者杀菌效果。大肠杆菌和金黄葡萄球菌用次甲基蓝染色液染色后，活菌显无色，死菌呈蓝色或者淡蓝色。4实验设备圆底烧瓶（100ml,250ml各1个）、温度计（150℃1支）、量筒（100ml2个）、烧杯（50ml6个250ml2个500ml1个）、索氏提取器（1套）、冷凝管带胶管（1套）、滤纸、中等试管（6支）、中等试管带棉塞（15个）、试管架（2个）、电热套（1个）、电炉（1个）、电热恒温鼓风干燥箱（1个）、台式高速离心机（1台）、UV-1100型分光光度计（1台）、电子天平（1台）、容量瓶（50ml100ml各2个）、刻度吸管（10ml2ml各1支）、培养皿（9个）、吸量管（1ml2支）、高压灭菌锅（1个）、酒精灯（1盏）、恒温箱（1个）、相差显微镜（1台）、试管刷（3个）、蒸发皿（1个）、三角架（1个）、锥形瓶（2个）、牛角管（1个）、石棉网（1个）、铁架台（2个）5实验材料及试剂材料：纯品芹菜素50mg、市售新鲜中国本土的小芹菜1kg（连同根、茎、叶）、大肠杆菌、金黄葡萄球菌试剂：HCl溶液（1.0mol/L，0.1mol/L）、NaOH溶液（1.0mol/L，0.1mol/L）、乙醇溶液（70％、50%）、乙酸乙酯350ml、乙酸2ml、乙酰水杨酸10mg、蛋白胨110g、牛肉膏33g、氯化钠45g、生理盐水、1%氯化铝溶液5ml、次甲基蓝染色液10ml6实验步骤66.1准芹菜素紫外标准曲线的制作6.1.1取芹菜素标准品5.55mg，用70％微热乙醇溶解，并定容于100ml容量瓶中，瓶中加两滴乙酸溶液，配成55.5µg/ml的溶液备用。量取表1所列芹菜素标准品溶液的毫升数，分别加入50ml容量瓶中用70％乙醇定容，配成不同浓度的芹菜素标准溶液。6.1.2分光光度计测芹菜素标准对照品溶液345nm处吸光值(结果填入7.1.1表2中)以浓度（µg/ml）为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线（见7.1.1中图2），并计算回归方程式。表1：芹菜中芹菜素的UV-标准曲线试验号123456芹菜素标样（ml）03691215浓度（µg/ml）03.336.669.9913.3216.656.2使用正交试验法对芹菜中芹菜素的提取工艺进行优化研究。6.2.1确定指标即实验的结果。本实验的指标是芹菜素提取浓度。6.2.2制定因素水平表考察四个因素（乙醇含量、料液比、提取时间、提取温度），每个因素取三个水平（如表3）。表3因素水平表6.2.3选择正交表水平A乙醇含量（%）B料液比（g:ml）C提取时间（min）D提取温度（℃）1601∶7.515402701∶1030503801∶12.545607可容纳四因素三水平的正交表有L9、L27和L18。本实验不考察各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为3的的四个因素，故选用L9表(L是正交表的代号，L右下角的数字表示试验次数)，见表4。表4正交实验表(L9表)试验号12341111121222313334212352231623127313283213933216.2.4具体操作步骤将本实验的四个因素依次放在L9的第1，2，3，4列，再将各列的水平数用该列因素相应的水平写出来，就得到下面的试验安排（见下表）8表5实验号123456789乙醇含量（%）606060707070808080料液比（g:ml）1：7.51：101：12.51：7.51：101：12.51：7.51：101：12.5提取时间（min）153045304515451530提取温度（℃）40℃预温5min,40℃提取50℃预温5min,50℃提取60℃预温5min,60℃提取60℃预温5min,60℃提取40℃预温5min,40℃提取50℃预温5min,50℃提取50℃预温5min,50℃提取60℃预温5min,60℃提取40℃预温5min,40℃提取表中试验号共9个，表示要做9次试验，每次试验的条件如每一纵行所示。6.2.4.1采摘芹菜叶，烘干磨碎，先后用乙酸乙酯对其进行预处理至提取液为无色，干燥后用电子天平分别称取15g，装入索氏提取器的滤纸筒中，将相应料液比、相应浓度的乙醇注入到提取器中，在相应温度下连续抽提相应时间。抽提结束后可对乙醇进行回收同时对抽提液初步浓缩。定性鉴定:取少量所得浓缩液于试管中，加入适量1%氯化铝溶液，进行芹菜素的鉴定。若溶液产生黄色络合物，则表明提取物为芹菜素粗品。6.2.4.2将提取液分别在3000r/min的离心机中离心，再浓缩上清液，测量浓缩后液体体积（VmL），用50％乙醇定容于100ml容量瓶中。吸取定容后的溶液5ml，注入100ml容量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，测其345nm处的吸光值，根据回归方程进行计算得测定稀释后的浓度为G，则可计算得从根茎叶中提取的芹菜素浓度为c=G×100/V×100/5=2000G/V（µg/ml）。结果如表6及图3所示。6.3从芹菜的根、茎、叶中提取芹菜素，比较芹菜素在不同部位的含量关系类似步骤6.2.4，分别对根茎叶进行操作，实验条件为上述的最佳实验条件。以上步骤平行进行三次，记录所得数据（见表7及图4），比较得出根、茎、叶中芹菜素的含量9关系。6.4探究芹菜素杀菌作用最佳剂量6.4.1以生理盐水制备将大肠杆菌制成五个浓度适当的菌悬液，编号A1~E1。6.4.2用生理盐水配置浓度为2.0㎎/ml、1.5㎎/ml、1.0㎎/ml、0.5㎎/ml的芹菜素溶液，分别吸取5ml溶液加入A1、B1、C1、D1大肠杆菌菌悬液中。E1菌悬液中加入5ml的生理盐水，作为空白对照组。6.4.3五个菌悬液均放置恒温箱中培养30min后，取出菌悬液，摇匀，用吸量管分别从A1~E1菌悬液中抽取1ml液体，运用OD600的方法测量其在波长为600nm时的吸光度。记录所得数据（见表8）。6.4.4再将菌悬液摇匀，用吸量管分别从A1~E1菌悬液中抽取1ml液体。用适量次甲基蓝染色液对各溶液染色，制成染色活菌液。观察其染色情况。6.4.5将步骤6.4.1的大肠杆菌换成金黄葡萄球菌，重复做步骤6.4.1～6.4.4。将数据分别填入表9中。6.4.6经两次实验的结果比较得出芹菜素抗炎效果最佳剂量为X(mg/ml)。6.5芹菜素与阿司匹林的有效成分乙酰水杨酸杀菌作用的比较6.5.1以生理盐水制备将大肠杆菌制成三个浓度适当的菌悬液，分别编号为A2、B2、C2。6.5.2用生理盐水配置浓度为X㎎/ml的芹菜素溶液和乙酰水杨酸溶液，分别吸取5ml溶液加入菌悬液A2、B2中。C2菌悬液中加入5ml的生理盐水，作为空白对照组。6.5.3按步骤6.4.3～6.4.4的方法对A2、B2、C2进行操作，并将数据填入表10中。6.5.4上述实验平行做三次。7结果及计算7.1标准芹菜素紫外标准曲线的制作7.1.1本实验6.1.2步骤实验结果:10表2各浓度标准芹菜素的吸光值芹菜素标准紫外测定标准曲线00.20.40.60.811.205101520浓度（µg/ml）吸光度吸光值图2芹菜素标准品紫外测定标准曲线7.1.2步骤6.1.2中芹菜素UV-标准曲线回归方程：本实验6.1.2步骤结果讨论：7.2使用正交试验法对芹菜中芹菜素的提取工艺进行优化研究。本实验6.2.4.2步骤实验结果:试验号123456芹菜素标样（ml）03691215浓度（µg/ml）03.336.669.9913.3216.65吸光值11表6正交试验法所测得的吸光度和芹菜素浓度实验号12345