真核基因组DNA的分离纯化

真核基因组DNA的分离纯化•核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的染色体DNA、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；•大多数生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3＇端带有polyA结构。分离纯化核酸总的原则：•①应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）；•②排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。•③无其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子时应去除RNA分子）。分离核酸应注意以下几点：•①减少化学因素对核酸的降解，•②减少物理因素对核酸的降解：•③防止核酸的生物降解：进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。核酸提取的主要步骤：•一般为破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。一、外周血白细胞DNA提取（NaI法）•【实验目的】•掌握NaI法提取外周血白细胞DNA的原理和方法。【实验原理】•从全血制备白细胞DNA，可用双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核，使核酸处于易提取状态，加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全（异戊醇去泡沫），DNA存在于上层水相中，以37%异丙醇沉淀DNA，离心弃去异丙醇，并重复操作一次，即可获得白细胞DNA。•【实验材料】•1、高速离心机。•2、各种所需试剂•【实验方法】•1．取新鲜抗凝血100μl置EP管中，离心10000r/min×1min。•2．弃上清，加ddH2O200μl，摇匀20s。•3．加6mol/LNaI200μl，缓慢倒置摇匀20s。•4．于管内加氯仿/异戊醇（24:1）400μl，摇匀20s，离心12000r/min×12min。•5．吸取上层水相360μl置一新Ep管中，加纯异丙醇200μl，摇匀20s。•6．室温放置15min，离心14000r/min×12min。•7．小心弃去上清，再加37%异丙醇1ml（勿摇动），离心14000r/min×12min。•8．小心弃去异丙醇，晾干。•9．加50μlTE缓冲液溶解DNA，以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20℃保存。【注意事项】•1．标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用EP管、吸嘴等器物及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。•2．混匀试剂、吸取上清等操作时应避免动作剧烈。•3．弃异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丢失。•4．0.54～1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%的乙醇漂洗DNA沉淀物。