真核生物组织DNA的提取

真核生物组织DNA的提取TotalDNAextractionfromeukaryotictissue实验目的了解真核生物基因组DNA提取的一般原理通过植物组织DNA的提取，掌握真核生物组织中DNA提取的方法和步骤高等动物、植物的基因组相当宠大，如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，果蝇基因组有１．４×１０８个碱基对。某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而研究的起点就是要获得纯度高－－不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；基因组相对完整－－断裂的基因组以便用于以后ＰＣＲ分析，RFLP分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出ＤＮＡ。DNA提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染实验原理植物细胞内各种DNA（包括基因组DNA和核外DNA）称为总DNA。高等植物的DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白（DNP），能溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液中，而不溶于有机溶剂。目前从样品中分离DNA的方法主要有两种，分为CTAB法和SDS法（型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来）。十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltriethylammoniumbromiade,CTAB)是一种阳离子去污剂，可以有效的裂解植物细胞壁，且与DNA形成可溶于高盐溶液的复合物，当降低盐浓度时DNA又可沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离。SDS（十二烷基硫酸钠）是阴离子表面活性剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。SDS法提取植物组织DNADNA含量和纯度的检测DNA的吸收光谱峰在260nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50µg/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。试剂提取缓冲液：100mmol/LTris·Cl(pH8.0),20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS24：1的氯仿：异戊醇预冷无水乙醇SDS抽提液配方(1000ml):操作步骤1.叶片0.5g左右,剪碎,置研钵中，加入1mL提取缓冲液，研磨成浆；吸入10mLEP管中，剧烈摇动混匀；2.60℃水浴保温30-60min，不时颠倒混匀；3.室温下3000rpm离心10min；4.小心吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇，剧烈震动；5.室温下3000rpm离心10min；6.小心将中间层吸入新的离心管中；7.加入1倍体积预冷95%乙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。8.8000rpm离心5min，弃掉上清；9.75％酒精洗一次，晾干沉淀；10.加入5μLRNaseA（10μg/μL）,37℃10min,除去RNA。11.加50-100μl水融解，-20贮存。结果分析与讨论