毒理学第六章一般毒性作用及其试验与评价方法.

上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录第六章一般毒性作用及其试验与评价方法第一节急性毒性作用及其试验与评价第二节亚慢性毒性作用及其试验与评价方法第三节蓄积毒性作用及其试验与评价第四节慢性毒性作用及其试验与评价上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录外来化学物在一定剂量、一定接触时间和接触方式下对试验动物产生的综合毒效应称为一般毒性作用。一般毒性作用根据接触毒物的时间长短又可分为急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录一、急性毒性的概念二、急性毒性试验的目的三、急性毒性试验方法的要点四、急性毒性分级和评价第一节急性毒性作用及其试验与评价方法上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录一、急性毒性的概念急性毒性是指机体（实验动物或人）一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应。第一节急性毒性作用及其试验与评价方法上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录1、急性接触的次数（一次或多次）24h内2、中毒效应出现的时间（一般为7-28d）急性毒性效应一般是指机体接触化学物后，在较短时间内观察到的毒性症状。3、中毒效应的强度急性毒性概念中的几个问题上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录1、测试和求出毒物的致死剂量以及其他急性毒性参数，通常以LD50为最主要的参数；2、初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量-反应（效应）关系和对人体产生损害的危险性；3、研究受试物在动物体内的动力学变化规律；4、为亚慢性、慢性毒性试验研究以及其他毒理试验提供接触剂量和观察指标选择的依据。二、急性毒性试验的目的上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录包括实验动物、染毒途径、染毒剂量、观察周期、观察指标的选择、计算方法和评价等。一般来说，一个新化学物在研制初期就要进行急性毒性试验。如果急性毒性试验通不过，则后面的所有试验都不必进行了。三、急性毒性试验设计上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录（一）实验动物的选择和要求尽量选择急性毒性反应与人近似的动物；易于饲养管理、试验操作方便的动物；繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应；价格较低，易于获得的动物。实验动物的选择包括物种和品系、年龄、体重、数量等方面，必须按照其规范要求进行。上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录1、实验动物的物种和品系急性毒性试验一般首先选择哺乳动物，选择两种或两种以上的动物。包括啮齿类和非啮齿类。啮齿类以大鼠、小鼠为最常用。非啮齿类以犬或猴最常用。急性毒性试验所用大鼠的品系以Sprague-Dawley（SD）、Wistar为主，小鼠则以昆明种、NIH、ICR为多。（一）实验动物的选择和要求昆明种小鼠（KM小鼠）特点：体型小，产仔多，生长繁殖快，饲养管理方便，对环境的适应性和对疾病的抵抗力强。广泛应用于药理毒力病理和细菌学研究，以及生物制品和药品的鉴定。NIH小鼠特点：体型小，产仔多，生长繁殖快，饲养管理方便，对环境的适应性和对疾病的抵抗力强。广泛应用于药理毒力病理和细菌学研究，以及生物制品和药品的鉴定。Wistar大鼠特点：抗病力强，自发性肿瘤发病率低，多用于肿瘤、免疫、药理、内分泌。SD大鼠特点：白色，产仔多，生长发育较Wistar大鼠快，对疾病的抵抗力较强，尤以对呼吸道疾病的抵抗力强。上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录2、实验动物的年龄和体重通常要求刚成年的动物，且为健康未受孕的动物。通常大鼠180～240g、小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、Beagle犬4～6kg、杂种犬8～15kg。（一）实验动物的选择和要求上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录3、实验动物的性别通常要求为雌雄各半。但如有资料或预试验发现试验品对雌、雄动物毒效应有明显的性别差异，则应单独分别试验并求出雌性和雄性动物各自的LD50值。（一）实验动物的选择和要求上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录4、实验动物的预检应先进行动物的给药前检疫观察。大鼠、小鼠、豚鼠、兔的检疫期为1周，犬、猴等适当地延长至2～3周。设定检疫期有两个主要目的：一是让外购来的实验动物要适应一段时间，减少环境和生理条件变化对试验结果的影响；二是筛检健康等不符合试验要求的动物（一）实验动物的选择和要求上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录5、实验动物的给药前禁食处理采用经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰，因此在试验给药前应作禁食处理。大鼠在前一天傍晚下班时或晚间将饲料撤掉。小鼠由于其消化吸收和代谢速度较快，可隔夜禁食也可禁食4h以上。（一）实验动物的选择和要求上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录（一）实验动物的选择和要求6.试验动物的饲养环境恒定的温度：22±3℃湿度：30~70%光照度：昼夜各半饲料合格、饮水合格、垫料合格上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录不同的LD50计算方法对动物组数的要求有所不同，一般为5~7组。大、小鼠等小动物每组数量通常为不少于10只，家兔每组不少于8只，犬等大动物每组不少于6只。严格按照随机分组进行。（二）实验动物分组与数量上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录受试物的接受、分样、保管、称量、配制以及在此过程中严格的质量保证是急性毒性试验成功与否的重要环节。受试物的化学结构、纯度、杂质成分、理化性质特别是挥发性、溶解性等均需了解。计算试验所需受试物的总量，一次备齐全部实验的用量。应以同一批号为宜。（三）受试物及处理上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录（四）染毒剂量及分组一般推荐，染毒最大量为：①经口20ml/kg（对空腹动物）；②经皮2ml/kg（根据体表面积计算，限于染毒的准确性）；③静脉1ml/kg（5min以上）；④肌内注射0.5ml/kg（一个部位）；⑤每眼0.01ml；⑥直肠0.5ml/kg；⑦吸入2mg/L；⑧鼻：猴或犬每鼻孔0.1ml。上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录染毒途径（exposureroutes）的选择需考虑：1.模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；2.有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；3.受试物的性质和用途；4.各种受试物毒性评价程序的要求等。（五）染毒方法上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。吸收速率依次排列，一般是静脉注射＞吸入＞肌内注射＞腹腔注射＞皮下注射＞经口＞皮内注射＞经皮。（五）染毒方法上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录1、经口（胃肠道）染毒灌胃喂饲吞咽胶囊（五）染毒方法上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录2、经呼吸道染毒研究生产条件下以气体、蒸气、粉尘、烟、雾等形式存在于车间空气中的工业毒物，评价环境空气污染物，以吸入为给药途径的药物，常常采用经呼吸道染毒的途径。（五）染毒方法上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录3、经皮肤染毒经皮肤染毒的方式：先使用化学法脱毛（常用脱毛剂为硫化钡加滑石粉1：4或硫化钠加淀粉1：4）或机械法脱毛（剪剃去毛），将动物脊柱两侧背毛脱去，去毛面积常为体表面积的10％。局部涂敷受试物并以玻璃纸覆盖固定一定时间接触染毒。（五）染毒方法上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录4、经注射途径染毒对注射药品或需作比较毒性观察的药品进行急性毒性试验时，须作经注射途径染毒。注射途径可分为静脉注射或滴注、腹腔注射(ip)、肌内注射(im)、皮下注射(sc)、皮内注射(id)、椎管内注射等。（五）染毒方法上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录查阅文献①了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。②确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组。LD50的计算方法常用改良寇氏法、概率单位法、霍恩氏法等。③找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。（六）剂量选择上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录一般来说，化学结构和性质比较近似的毒物，毒性也比较近似。通过以上资料从而对受试物毒力做出估计，以预期毒性剂量设计预实验方案。每个剂量组间的组距可大些，以便寻找出受试物的致死剂量范围。（六）剂量选择目的是找出0％及100％估计致死量。更确切地说是找到一个0死亡的最大剂量和100％死亡的最小剂量的估值以决定实验中采用的最大剂量(Dm)和最小剂量(Dn)，这在测定中非常重要，是实验成败的关键。预试验上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录预试验①设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l~2个剂量组作为预试验剂量；②根据确定的剂量组进行染毒；③根据预试验的死亡资料确定组距。可根据以下公式计算出剂量分组：i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1)或：i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)公式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)；n为设计的剂量组数。一般来说、根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。例如寇氏法、几率单位法一般设6～10个剂量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得i值后，以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。123456LgLD0LgLD0+iLgLD0+2iLgLD0+3iLgLD0+4i•••正式试验上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录对未知毒性的化学物，估计毒性较低时，预试验也可以5g/kg剂量进行摸索，来决定是否需正式求LD50。一般来说，化学物LD50如大于5g/kg已表明毒性不大。我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡，方可不进一步试验求出LD50值。急性毒性试验除设立几个剂量组外，是否设正常和溶剂对照组，根据需要确定。（六）剂量选择上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录急性毒性试验一般是以死亡为主要记录内容。除此之外还要注意：中毒体征及发生过程；死亡情况和时间分布；体重病理形态学变化。（七）毒性作用观察上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录1、中毒体征及发生过程应详细观察和记录动物出现的中毒体征、发生时间和体征发展的经过。机体对毒物作用的反应可以表现出各个系统的特征。（七）毒性作用观察上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录上一内容回主目录返回下一内容返回上一内容下一内容回主目录2、死亡情况和时间分布急性毒性试验中实验动物的死亡数是计算LD50值的依据，动物死亡数量每增加或减少一只都会对LD50值产生明显影响，因此