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编号:2010041152毕业论文（2014届本科）论文题目：大肠杆菌噬菌体分离纯化研究学院:生命科学与技术学院专业:生物科学班级：10级生科（1）班作者姓名：郑小云指导教师：毛宁职称：助教完成日期：2014年6月3日目录陇东学院本科生毕业论文诚信声明...............................................................................1大肠杆菌噬菌体分离纯化研究.......................................................................................2摘要...................................................................................................................................2关键词...............................................................................................................................2ResearchonseparationandpurificationofE.coliphage..................................................2Abstract.............................................................................................................................2Keywords.........................................................................................................................21引言................................................................................................................................22材料与方法...................................................................................................................32.1材料.............................................................................................................................32.2方法.............................................................................................................................32.2.1大肠杆菌噬菌体的分离..........................................................................................32.2.2大肠杆菌噬菌体的纯化..........................................................................................42.2.3噬菌体效价的测定..................................................................................................42.2.4噬菌体对大肠杆菌的裂解曲线..............................................................................52.2.5Ca2+、Mg2+对噬菌体裂解率的影响......................................................................53结果与分析....................................................................................................................53.1噬菌体的分离与纯化.................................................................................................53.2噬菌体效价的测定.....................................................................................................63.3噬菌体pha1对大肠杆菌的裂解曲线.......................................................................63.4Ca2+、Mg2+对噬菌体裂解率的影响.........................................................................74讨论................................................................................................................................7参考文献...........................................................................................................................8致谢.............................................................................................................................101陇东学院本科生毕业论文诚信声明本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：二O一年月日2大肠杆菌噬菌体分离纯化研究郑小云（陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳745000）摘要：以本实验室保藏的大肠杆菌E.coliNO1和E.coliNO2为宿主菌，采用双层琼脂平板法从环境污水中分离纯化得到一株烈性大肠杆菌噬菌体Pha1，研究其对大肠杆菌的裂解曲线及Ca2+、Mg2+对噬菌体裂解率的影响。结果表明，噬菌体pha1对E.coliNO1有较强的裂解作用，对E.coliNO2没有裂解作用；在培养基中添加Ca2+和Mg2+时，噬菌体出斑率明显高于对照，说明Ca2+和Mg2+均可促进噬菌体生长；当加入200mg/L的Ca2+或250mg/LMg2+时，相对出斑率最高，分别达到187%和178%。关键词：大肠杆菌；噬菌体；分离纯化ResearchonseparationandpurificationofE.coliphageZHENGXiao-yun(Collegeoflifescienceandtechnology,LongdongUniversity,QingyangGansu745000)Abstract:AstrainofbacteriophagePha1wasisolatedfromwastewaterusingdoublelayeragarplatemethod,WiththeE.coliNO1andE.coliNO2preservedinourlaboratoryasthehostcell.ThecurvesofE.colilysedbyPha1andtheeffectsofCa2+,Mg2+onphagecrackingratewasstudied.Theresultsshowedthat,pha1hadstrongschizolysiseffectonE-coliNO1,butnoeffectonE-coliNO2;thenumberofplagueswassignificantlyhigherinthemediumsupplementedwithCa2+andMg2+thaninthecontrol,whichindicatedthatCa2+andMg2+couldpromotethegrowthofpha1;whenadding200mg/LCa2+or250mg/LMg2+,theplaguesratiowasthehighest,reaching187%and178%respectively.Keywords:E.coli;phages;isolatingandpurifing1引言噬菌体是一类感染细菌、放线菌等微生物的病毒，体积微小、结构简单、具有严格的寄生性，广泛分布于自然界中[1]。噬菌体作为指示微生物，在监测水质环境、指示污染程度等方面的研究也有了一些进展[2]。因此，分离和研究噬菌体，弄3清楚噬菌体与其宿主之间的生态学关系，对于监测水质环境，控制水质污染等方面的工作无疑具有指导意义。鉴于噬菌体有溶菌作用和严格的种型特异性[3]，可利用噬菌体作细菌的鉴定和分型，亦可用于检测标本中的未知细菌和防治某些传染病[4]。噬菌体作为一种新的治疗制剂已受到广泛关注[5]。本研究旨在通过分离大肠杆菌噬菌体,研究其生理特性，为将噬菌体作为一种生物制剂，应用于治疗细菌性感染等方面提供参考和依据。2材料与方法2.1材料噬菌体样品来源：阴沟污水（100ml）菌种：陇东学院生命科学与技术学院微生物实验室保藏的大肠杆菌E.coliNO1和E.coliNO2培养基：3倍牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏培养液，牛肉膏蛋白胨半固体培养基（倒上层用），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒底层平板用）[6]试验器材：离心机，细菌滤器，抽滤装置，恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，无菌涂布器，无菌吸管，培养皿，三角瓶，移液管，试管，漏斗等2.2方法2.2.1大肠杆菌噬菌体的分离[7,8]A.培养大肠杆菌：活化培养实验室保藏的大肠杆菌E.coliNO1和E.coliNO2至对数期（OD600值0.8左右）。B.增殖噬菌体样品：取上述大肠杆菌培养液6ml于盛有50ml3倍牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，后加入污水样100ml（离心并过滤除菌），继续37℃摇床振荡培养12~14h，以增殖噬菌体。C.富集噬菌体：将以上培养液3000r/min离心30min，将上清液过滤除菌，取100ml滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养12~18h进行噬菌体富集。将以上富集液3000r/min离心30min后，取上清液10mL加入5mL3×倍牛肉膏蛋白胨培养液及相应宿主菌液1mL，室温下放置1