毕业论文实验方案

赣南师范学院生命与环境科学学院毕业论文实验方案论文题目：滤纸糖化力法测定纤维素酶活性条件的研究学生姓名：刘淼学号：100907025指导老师：卢占军博士起止时间：2013年3月-6月实验原理:利用蛋白质分离纯化方法，从枯草芽孢杆菌中分离出纤维素酶，将其分别作用于羧甲基纤维素（CMC）和滤纸，其生成的还原性糖能和3.5--二硝基水杨酸（DNS）反应生成棕红色物质，利用分光光度法测出纤维素酶的活性强度。纤维素酶滤纸糖纤维二糖、葡萄糖等还原性糖+DNS棕红色物质药品材料：氢氧化钠、葡萄糖、3.5--二硝基水杨酸（DNS）、硝酸、冰醋酸、醋酸钠、酒石酸、滤纸、纤维素酶制剂；仪器：分光光度计、恒温水浴锅、干燥箱、分析天平；实验设计：一、实验前期准备工作:1、醋酸-醋酸钠缓冲液的配制：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸溶液。称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸钠溶液。使用时以4：6的比例混合，低温冷藏备用。2、葡萄糖溶液的配制：将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。3、3.5--二硝基水杨酸的配制：准确称取DNS6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/LNaOH溶液262mL，再加到500mL含有185g酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL，充分混匀。4、葡萄糖标准曲线的绘制：取8支洗净烘干的25mL具塞刻度试管，编号后依次加入0ml0.2ml0.4ml0.6ml0.8ml1.0ml1.2ml1.4ml葡萄糖标准溶液,然后用蒸馏水分别定容至2.0ml。配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入1.5mLDNS溶液，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至25mL，充分混匀。在540nm波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。二、滤纸对实验的影响分析：由于滤纸中也含有一定量的还原性糖，所以试验中应该排除底物对实验的影响。称取等量碾碎的滤纸与DNS充分反应，测其OD值。三、酶促反应时间的研究：酶的反应时间不同，其产物浓度也不一样。依次取反应时间为0min2min4min6min8min10min12min14min的反应体系，加入DNS充分显色测其OD值。四、DNS试剂量的确定：DNS本身也具有一定的颜色，如果过量也会对实验结果造成影响，所以应该设计实验确定DNS的加入量。取相同酶反应体系，分别加入0.3ml0.6ml0.9ml1.2ml1.5ml1.8ml2.1ml2.4ml显色剂DNS充分显色，测其OD值。五、吸收波长的确定：取450nm-590nm波长段，以每20nm一个区段，分别测其OD值，绘图分析结果。六、沸水浴显色时间的确定：取相同酶反应体系，DNS沸水显色分别取1min3min5min7min9min11min13min15min的OD值，分析结果。七、显色后吸光度稳定性的研究：分别测量反应体系显色后15min20min25min30min35min40min45min50min的吸光度，分析结果。八、数据的处理，绘图以及结论分析：九、论文写作：一、目的要求（1）学习并了解生物化学实验的基本过程与基本方法，培养发现问题、解决问题的能力，养成科学实验的良好习惯。（2）学习并了解纤维素酶的基本特性，学习酶活力测定的方法。（3）学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法。（4）学习实验方案的制定与调整、数据的处理及实验报告的撰写。二、实验基本要求1．根据相关资料，提出实验方案实验前，根据有关资料，了解该酶的基本特性、酶活力测定的基本原则与要求，拟订初步实验方案，包括实验原理，实验的步骤及目的等。2．修订实验方案提出实验方案，经过老师修改后，确定最终的实验方案，并开始进行实验。具体任务是：制作还原糖—吸光度的标准曲线；测定样品中的纤维素酶活力。3．数据处理与实验报告根据实验测定的结果，采用计算机分析处理有关实验数据，并利用计算机绘制标准曲线，计算相关系数（r），利用回归方程计算获得实验结果。最后将整个实验过程（包括实验设计、实验操作、结果分析等过程）以实验报告形式呈交。三、主要内容提出实验设计，制作还原糖—吸光度的标准曲线；测定不同底物时的纤维素酶活力。四、参考资料——纤维素酶活性检测方法介绍纤维素酶活性检测方法介绍纤维素酶活性检测方法介绍纤维素酶活性检测方法介绍（一）原理纤维素被纤维素酶水解最终降解生成β-葡萄糖。鉴于纤维素结构的复杂性，没有任何一种酶能将纤维素彻底水解。1950年Reese提出了C1-Cx概念。C1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区（如棉花纤维即为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。再由Cx最终催化形成还原性单糖。而Cx通常包括：（1）内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)。这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子（羧甲基纤维素钠（CMC）即为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，简称CBH）。这类酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG），这类酶将纤维二糖（水杨素即为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。据上述理论，分别设计以滤纸（filterpaper）、棉球、CMC、水杨素为底物，分别衡量纤维素的总体酶活性（FPA）、C1、Cx、Cb酶活性。将底物水解后释放还原性糖（以葡萄糖计）与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应产生颜色变化,这种颜色变化与葡萄糖的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。（二）纤维素酶类活性的定义Ⅰ1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1×6cm的滤纸（FPA）产生1µg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个FPA酶活力单位。Ⅱ1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解50mg的脱脂棉球产生1µg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个C1酶活力单位。Ⅲ1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1%CMC溶液产生1µg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个Cx酶活力单位。Ⅳ1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1%水杨素溶液产生1µg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个Cb酶活力单位。（三）实验材料与仪器1.试剂（实验所使用的试剂若无任何说明，均为分析纯）（1）定性滤纸,脱脂棉球，（2）0.1mol/L乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH4.8）溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸溶液。溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸钠溶液。使用时以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。（3）DNS显色剂:溶液A:称分析纯的NaOH104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3,5－二硝基水杨酸。溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。将A、B溶液混合，加入1200ml水，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用。（4）CMC（1%）准确称取1.000g羧甲基纤维素钠，用pH4.8醋酸缓冲液溶解，定容至100ml。（5）水杨素（1%）准确称取0.25g水杨素，用pH4.8醋酸缓冲液溶解，定容至25ml。（6）标准葡萄糖溶液的配制无水葡萄糖80℃烘干至恒重，准确称取100mg溶于100ml水中，加1mg叠氮化钠防腐。4℃冷藏备用。（7）酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至100ml，则该酶已经稀释100倍。2.仪器水浴锅(恒温，50±0.5℃)，722型分光光度计，一级玻璃制品，冰箱，热干燥箱（80±1℃），分析天平（感量0.1㎎）。五、操作步骤1.标准曲线的绘制（1）取7支带有15ml刻度的试管，按下表取试剂试管号0123456取标准葡萄糖溶液（ml）00.20.40.60.81.01.2蒸馏水（ml）21.81.61.41.21.00.8葡萄糖的实际含量（mg/ml）00.10.20.30.40.50.6DNS显色剂（ml）2222222沸水浴10min定容（ml）15mlOD550（2）上述过程同时进行三个平行测试，测得OD值与葡萄糖mg数在计算机上或人工拟合曲线，求得Y=ax+b一元线性方程中间的a和b值。要求所绘曲线相关系数r≥0.999。2.酶活性测定ⅠFPA活力单位的测定活力单位的测定活力单位的测定活力单位的测定（1）取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液，再加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。（2）取其中3支作为测定管，各加1×6cm滤纸条，充分浸泡置50±0.5℃恒温水浴60min。（3）另一支作为空白管同时置50±0.5℃恒温水浴60min。（4）然后分别加入DNS显色液2ml，空白管同时加1×6cm滤纸条。（5）放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。ⅡC1活力单位的测定活力单位的测定活力单位的测定活力单位的测定（1）取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液，再加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。（2）取其中3支作为测定管，各加50mg的脱脂棉球，充分浸泡置50±0.5℃恒温水浴60min。（3）另一支作为空白管同时置50±0.5℃恒温水浴60min。（4）然后分别加入DNS显色液2ml，空白管同时加50mg的脱脂棉球。（5）放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。ⅢCCCCx活力单位的测定活力单位的测定活力单位的测定活力单位的测定（1）取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液。（2）取其中3支作为测定管，各管再加1.8mlCMC（1%），另一支作空白管，同时加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。然后置50±0.5℃恒温水浴60min。（3）然后分别加入DNS显色液2ml。（4）放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。ⅣCb活力单位的测定活力单位的测定活力单位的测定活力单位的测定（1）取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液。（2）取其中3支作为测定管，各管再加1.8ml水杨素（1%），另一支作空白管，同时加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。然后置50±0.5℃恒温水浴60min。（3）然后分别加入DNS显色液2ml。（4）放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。3.活性的计算（1）将测得的各平行样求OD值的均值。（2）计算纤维素酶类的活性单位依据以下公式纤维素酶活力=U/g(ml)式中x：为样品OD值的平均值；b和a：由葡萄糖浓度和相应的OD值通过回归方程求得n：酶粉（液）的稀释倍数；T：酶促反应的时间；0.2：所加酶液的量六、实验结果根据上述提供的资料提出自己的具体实验方案，列出实验的具体步骤，经指导老师批准后开始进行实验，并