氨基酸分析

2.2.56氨基酸分析（1）（见注解）氨基酸分析是指利用方法对蛋白质，多肽和其他药物制剂进行氨基酸组成或含量的分析。蛋白质和多肽一般是氨基酸残基以共价键的形式组成的线性大分子。蛋白质或多肽中氨基酸的序列决定了其分子的性质。蛋白质普遍是由大分子以折叠的方式形成的特定构象，而多肽则比较小，可能只有几个氨基酸组成。氨基酸分析方法可以用于对蛋白质和多肽的量化，基于氨基酸的组成来确定蛋白质或多肽的类型，支撑蛋白质和多肽的结构分析，评估碎片肽段，并检测可能存在于蛋白质或多肽中的不规则氨基酸。并且在氨基酸分析之前必须进行将蛋白质或多肽水解为个别氨基酸。伴随着蛋白质或多肽的水解，氨基酸分析的过程和其他药物制剂中氨基酸的游离是一致的。通常我们采用易于分析的方法来测定样品中的氨基酸成分。设备用于氨基酸分析方法通常是基于色谱分离氨基酸的方法设定的。当前的方法是利用自动化色谱仪进行分析。氨基酸分析仪通常是一个能够产生梯度的低压或高压的液相色谱仪，并在色谱柱上分离氨基酸。除非样品在柱前进行了衍生化，否则这些仪器必须具备柱后衍生化的能力。检测器使用的是紫外可见光检测器或荧光检测器。此外，还需具有一个记录仪器（例如，积分仪），用于转化检测到的信号及用于定量测定。而且，这些仪器是专门用于氨基酸分析使用的。一般预防策施在氨基酸分析中，分析师关注的一个重点是背景的污染。高纯度的试剂是必要的（例如，低纯度的盐酸的使用在分析中会产生甘氨酸污染）。分析试剂通常是每隔几周更换一次，并且仅使用HPLC级别的溶剂。所用试剂使用之前必须用过滤器将溶剂中可能潜在的微生物和外来材料污染过滤除去，保持溶剂贮存器出于密封状态，并且不可将氨基酸分析仪放置于光照条件下。实验室的操作规范决定了氨基酸分析的质量。仪器应放置在实验室的空旷区域。保持实验室的卫生干净。根据维修计划，及时清洁和校准移液管，将移液吸头放置在相应的盒子中，分析师不得用手处理移液管。分析师需要穿戴一次性的乳胶手套或同等质量的其他手套。限制测试样品瓶开启和关闭的次数，因为飞灰可以提高甘氨酸，丝氨酸和丙氨酸的浓度。良好的仪器状态是氨基酸分析结果可接受的一个关键步骤。在日常使用过程中，必须每天检查是否漏液、检测器和灯的稳定，色谱柱分离个别氨基酸的能力。定期清洗或更换所有仪器的过滤器和其他需要维修的项目。参考标准物质氨基酸分析的可接受标准是商业上可用，通常是包含一水化合物的氨基酸。在确定氨基酸组成时，蛋白质或多肽的标准进行材料的分析与控制作为验证整个过程的完整性。高纯度的牛血清白蛋白可用作蛋白质标准。仪器的校准氨基酸分析仪的校准通常包括氨基酸的分析标准：如混合氨基酸的浓度，确定影响因子和每个氨基酸的检测范围。每个氨基酸的标准浓度都是已知的。在校准时，分析师将氨基酸标准物在预期的线性水平条件下稀释至几个不同的分析浓度。然后，重复检测可以分析的每个检测浓度。每个获得的氨基酸峰面积和已知浓度的标准物质浓度进行线性绘图。所得的结果显示给定氨基酸的峰面积和浓度呈线性关系从而帮助分析师确定氨基酸的浓度范围。分析师准备的氨基酸样品必须在分析范围内（例如，线性范围），以获得准确可重复的结果。根据4-6个氨基酸标准水平，由标准每nmol氨基酸的平均峰面积或峰高计算每个氨基酸的响应因子。包含响应因子的校准文件是需要准备并使用在测试样品中每个氨基酸浓度的计算中。这个计算是通过给定nmol浓度氨基酸确定的相应因子分裂给定氨基酸的峰面积。常规分析中，单点校准可能已经足够，可是校准文件需要经常更新以及通过分析控制来测试样品，以确保它的完整性。重复性每个分析实验室分析结果的重复性是获得高质量氨基酸分析结果的关键。在色谱分离氨基酸或它们的衍生物时，可以观察到相应氨基酸色谱图的峰面积。大量的氨基酸峰面积构成氨基酸分析系统，并通过保留时间和积分所得的峰面积进行定量。典型的重复性评估包括标准氨基酸溶液的准备和多次的重复分析同一个标准溶液（即，6个标准的分析或更多）。并计算每个氨基酸的保留时间和峰面积的RSD。重复性的评价也包括由不同的分析师进行数天的多次分析。这些多次分析包括由于原料标准稀释处理带来的变化。通常，我们把一个标准蛋白质（如牛血清蛋白）的氨基酸分析作为重复性评估的一个部分。通过对多次分析的评估，实验室可以建立一个分析限度，以确保实验在分析控制下进行。通过建立一个最低的实际变化限度来确保得到最好的试验结果。同时需要密切关注降低氨基酸的变化分析的因素：样品的制备，由于试剂的质量和或实验操作引起的高背景的光谱干扰，仪器的性能和维护情况，数据的分析与解析，分析师的分析能力和习惯。所有的参数都是全面研究的验证工作范畴。